Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme
Summary
Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.
Abstract
Spinal motoneurons (MNs) ateş içinde nörolojik bozukluklar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı ve spinal kas atrofisi, kas atrofisi ile ilişkili tüm olan da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede karıştığı. Omurilik MNs birincil kültürleri belirli genler gibi hastalıklar tutulumu göstermek ve onların mutasyonların hücresel sonuçları karakterize yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu iletişim kuralı modelleri birincil MN kültür Henderson ve arkadaşları seminal işten daha fazla yirmi yıl önce türetilmiş. İlk olarak, bir fare embriyo Medulla Spinalis ön boynuzları anatomi ve hücreleri bir yoğunluk gradient kullanarak komşu gelen MNs izole bir yöntem ayrıntı. O zaman, biz verimli bir şekilde transfecting MNs magnetofection kullanarak ifade Plasmid’ler ile yeni bir yol mevcut. Son olarak, biz nasıl düzeltmek için ve immunostain MNs. Charcot Marie Tooth hastalığı tip 2 neden neurofilament mutasyon kullanarak, bu iletişim kuralını proteinler ilgi ifade ve onların katılımı eğitim nitel bir yaklaşım gösteriyor birincil göstermek MN büyüme, bakım ve hayatta kalma.
Introduction
A değişiklik-in kas ve/veya sinir sisteminin değiştirilmesini tarafından karakterize klinik ve genetik olarak farklı patolojiler nöromüsküler hastalıklar kapsamaktadır. Sıralama teknolojik gelişmeler nedeniyle, son on yılda genlerin bu nadir hastalıklar için sorumlu yüzlerce tespit edilmiştir (liste Neuromuscular hastalığı Merkezi, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Tek bir gen farklı mutasyon farklı fenotipleri ve hastalıkları1,2,3 neden olabilir ve farklı genlerdeki mutasyonlar benzer fenotipleri üretebilir saptanan mutasyon çeşitli gösterir 4 , 5. Bu bağlamda, mutasyon sonuçları ve patolojik mekanizmalarını analiz etmek için güçlü araçlar olabilir hücresel modellerinin geliştirilmesi için çaba vardır.
Omurilik MNs ventral boynuzları omurilik, iskelet kas lifleri hedef ve nöromüsküler kavşak, asetilkolin serbest yoluyla gönüllü hareketler için izin vermek için form uzun aksonlar yer alan büyük somas var. MNs nöromüsküler hastalıklar gibi amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı (CMT), etkilenen ve spinal kas atrofisi, Dr Henderson ve arkadaşları ekimi için izin verilen ilk Protokolü6 geliştirilmiş Tüp bebek spinal MNs ve keşif nörotrofik faktör GDNF7 (gliyal hücreye türetilmiş Nörotrofik faktörü). O zamandan beri teknik ayrıntılandırmaları spinal MNs ve FACS8kullanarak kendi alt türlerinden daha doğru arıtma için izin vermiş, ancak güçlü ve yaygın olarak kullanılan birincil spinal MNs ile çalışmakta laboratuarlarında zenginleştirme yoğunluk gradient tarafından kalır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. daha sonra immunopanning bir daha yüksek MN arıtma sınıfa yüzey işaret p75(NTR)15,16,17yararlanarak elde etmek mümkündür.
Omurilik boyun, göğüs ve bel MNs yanı sıra ön boynuz dorso-ventral ekseninde konumlarında arasında farklılık medyan ve yanal motor sütunları farklı alt türlerinden içerir ve hedefler arasında onlar8, innervate 18. birincil MN kültürleri tüm fizyolojik oranlarda bu MN türlerinden kurtarabilirsiniz. Ana bu teknik MNs yordamın bitiminde elde edilen az sayıda kısıtlamasıdır; Aslında, yaklaşık 105 MNs mikroskobu ama Biyokimya deneyler için sınırlama için uygun olan altı embriyolar elde etmek için beklenebilir. Deneyler daha standart alt türlerini ve bol MNs gerçekleştirmek için (> 106 hücreler), embriyonik kök hücre kaynaklı MNs18düşünülmelidir.
Birincil MNs içine vahşi-türü/mutant transgenes veya devirme endojen genlerin transfection özellikle fare modelleri kullanılamaz olduğunda fizyopatolojik yolları, deşifre için hızlı ve yararlı bir araçtır. Magnetofection için transfecting birincil nöronlar, lipofection ilgili nörotoksisite olmadan benzer bir tekniktir. Ayrıca, transfection olgun nöronlar üzerinde birkaç gün vitro, adım9tarihinde temel teknikleri aksine sonra gerçekleştirilebilir. Ancak, bu tekniğin bir dezavantaj boncuk DAPI etiketleme gürültü neden kültür, nükleik asitler bağlamak olduğunu. Viral enfeksiyon büyük olasılıkla transfecting MNs için en etkili tekniktir; Ancak, magnetofection viral üretim ve hücresel enfeksiyon için gerekli bazı güvenlik prosedürleri gerektirmez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı kritik noktaları fare embriyo sırasında geliştirme (E12.5) sonunda elde edilen un miktarı optimize etmek için bir kesin zaman penceresinde disseke biridir. Buna ek olarak, en iyi verim için diseksiyon sabah ya da öğleden sonra erken yapılmalıdır. Daha önce E12.5 (Örneğin, E11.5 adlı), diseksiyon meninkslerde kaldırılması ile ilgili özellikle zordur. E12.5 sonra elde edilen MNs sayısı önemli ölçüde düşer. Gelişiminin embriyo aşamasında denetlemek için yetişkin…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
“Derneği pour le développement de la neurogénétique” Dr. Jacquier’ın bursu ve AFM-Telethon için MyoNeurAlp stratejik planı ile verdiği destek için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Chris Henderson, Dr William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul ve Doktor Georg Haase, geliştirme ve teknik geliştirme katılan ve onların bilgi yaymak teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
Referencias
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
