质谱 (MS) 已成为研究大分子组件结构和动力学的重要工具。在这里, 我们整合了基于 MS 的方法来询问蛋白质复合形成和配体结合。
蛋白质是一种重要的生物大分子类, 在细胞功能中发挥许多关键作用, 包括基因表达、催化代谢反应、DNA 修复和复制。因此, 对这些过程的详细理解提供了有关细胞功能的重要信息。综合结构 MS 方法提供结构和动态信息的蛋白质复杂的组装, 复杂的连接, 亚基化学计量, 蛋白质齐聚和配体结合。在集成结构 MS 的最新进展允许表征具有挑战性的生物系统, 包括大 DNA 结合蛋白和膜蛋白。本协议描述如何将各种 ms 数据 (如本机 ms 和离子迁移率-质谱 (IM ms)) 与分子动力学模拟相集成, 从而深入了解解旋酶-核酸酶 DNA 修复蛋白复合物。由此产生的方法提供了一个框架, 详细研究配体结合到其他蛋白质复合物参与重要的生物过程。
使用电喷雾和纳米电喷雾电离 (内西) 对完整蛋白质及其配合物进行原生质谱分析, 在电离过程中保留蛋白质折叠和非共价相互作用1, 2。在本机 MS 中, 蛋白质及其配合物的结构在气相3、4中保持在近原生状态。本机 MS 检测多个电荷蛋白离子, 它们根据其质量与电荷比 (m/z) 分离, 从而可以计算出蛋白质或蛋白质配体复合物的质量。此信息可以确定完整的蛋白质的化学计量学、亚基组成、配体结合和相互作用网络3、4、5、6。与其他技术相比, 本机 MS 具有多种优点, 如 X 射线晶体学和核磁共振波谱学5。首先, 本机 MS 是一种快速且高度灵敏的技术, 仅需少量微升 (2-3 µL) 的样品在高 nM 至低µM6范围内相对较低的最终复合浓度。其次, 本机 MS 可用于查询异构蛋白质样本, 从而可以同时分析多种蛋白质和寡聚状态。第三, 在通过化学交联或蛋白质标签进行分析之前, 本机 MS 不需要修改蛋白质样品。这些优势使结构 MS 成为蛋白质复合体结构研究的有力工具。
本机 MS 可与离子迁移 (IM) 相结合, 这是一种测量蛋白质离子在电场中穿行所需时间的技术, 能够确定碰撞剖面 (CCS)。CCS 提供低分辨率的结构信息, 可实现蛋白质的拓扑结构和构象异质性信息。此外, 它允许检查计算方法产生的蛋白质结构模型。
利用 CIU 测量的碰撞诱导展开法, 可以研究蛋白质气相稳定性。在 CIU 过程中, 通过在质谱仪7、8、9中使用惰性缓冲气体增加加速碰撞, 加速和激活蛋白质离子。这种碰撞活化过程导致蛋白质部分地展开, 这转化为 CCS 的增加。CCS 的这种变化和展开蛋白质所需的能量可以通过 IM MS 来测量. 采用这种方法, 可以测定配体结合对蛋白质稳定性的影响10。Subcomplexes 可以在溶液中生成, 使用溶液中的破坏方法, 如添加有机溶剂来监测蛋白络合物的类似于本机的拓扑。蛋白质复合物的破坏主要是由于内部非共价相互作用的破坏。子复合体维护类似于本机的拓扑结构, 并在 MS 检测时显示有关亚单位间连接的信息。
结构生物学中的综合方法结合多种方法研究蛋白质及其配合物的结构和动力学3、4、5、6。本机 ms 和 IM ms 已被用来揭示具有挑战性的生物系统的分子细节。有几个例子的应用, 包括研究蛋白质组装通路11,12,13,14, 研究蛋白质-蛋白质相互作用网络15,16,17、膜蛋白6、18、19、20、21和蛋白质配体相互作用, 如核酸22、23 ,24。
但是, 本机 MS 也有其局限性。本机 MS 测量通常在挥发性缓冲液中进行, 例如醋酸铵, 某些蛋白质不会保留其折叠的原生状态3,25。然而, 最近的工作表明, 这一限制可以通过优化喷涂针尖端直径 (0.5 mm 尖端) 来克服, 这样就可以直接从具有高离子强度的非挥发性缓冲液中形成蛋白质和蛋白质复合离子, 从而更好地模仿生理环境26。此外, 本机 MS 使用电喷雾电离和转移非共价组件从溶液到气相;因此, 检测到的复合物的相对丰度可能并不完全表示在溶液5、27中。此外, 与溶液相比, 气相疏水性相互作用变得较弱, 静电相互作用变得更强, 因此青睐3,28。
在本文中, 我们提供了用于蛋白质识别和配体结合的协议、数据分析和解释, 使用本机 ms、IM ms、CIU、解决方案中断和建模。DNA 修复复合物, 赫拉-NurA, 被用作模型系统。dna 双链断裂 (DSBs) 是 dna 损伤的最毒和有害形式之一, 导致基因不稳定和人类癌症的最终发展。同源重组是根除 DSBs 的修复机制, 是由 ATP 依赖解旋酶-核酸酶复合物, 赫拉-NurA22所编排的过程。
将本机 ms 和 IM 与功能性检测和建模相结合, 可以调查: i) NurA 在复合体的装配、构象和稳定性中的作用, ii) dsDNA 与复合体的相互作用及其对整体的影响复合物的稳定性和 iii) ATP 结合对大会22的计量和影响。总的来说, 这项工作使人们更好地了解赫拉-NurA 复合物的分子基础, 将蛋白质复合构象变化和稳定性与核苷酸结合起来。该协议对于任何与一个或多个配体类型进行交互的蛋白复合体 (es) 都是通用的。
MS 在表征蛋白质复合物的化学计量、相互作用和亚基结构方面发挥着越来越重要的作用。IM MS 数据可用于定义多组分复合物中亚基的拓扑安排。与其他现有的结构生物学方法相比, MS 有几个优点。本机 MS 是一种快速且高度灵敏的技术, 可用于探测异构蛋白质样品。当与溶液内中断实验结合时, 可以监测蛋白质组件的分离通路。与晶体结构或同源模型一起, 结构 MS 提供的信息提供了研究蛋白质配体相互作用的工具, 并提供近原生模型和组装路径11。
在这里, 我们描述了必要的实验程序分析的化学计量和组成的蛋白质-配体相互作用, 用一个或多个配位, 使用集成 MS。这包括 ms 样品制备、数据采集、数据分析和使用计算工具集成 ms 数据。为此, 我们使用了 dna 切除赫拉-NurA 杂寡聚蛋白复合物, 绑定到三配体 (DNA、ATP 和 ADP), 作为我们的模型系统。该协议显示了使用当前可用的软件来帮助数据分析和演示。
获得高质量的光谱对配体结合分析非常重要, 因此, 仔细的样品制备步骤至关重要, 包括蛋白质纯化、配体滴定和缓冲液交换。在研究配体结合时, 内西本机 MS 的一个局限性是非特定绑定。在整个电喷雾过程中, 在液滴脱除过程中发生非特定的束缚。这增加了配体浓度, 因此改变了蛋白质/配体比29。核苷酸的结合会导致 apo 和核苷酸束缚蛋白之间的质量差异相对较小, 不会改变电离效率50,51。
我们使用 Synapt G2-Si MS 系统为我们的工作, 但协议适用于其他蛋白质配体配合物的不同研究使用其他商业可用的纳米电喷雾质谱仪。综合结构 MS 在处理更复杂的生物问题方面日益发挥着重要作用。这里描述的工作流程和技术非常适合于了解蛋白质复合物和蛋白质配体形成的结构影响和构建机制, 而这种结构在使用传统的构造技术时难以研究。.
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢卡尔-彼得 Hopfner 和罗伯特. 伯恩好心提供赫拉和赫拉-NurA 蛋白样品, 并为他们的实验设计帮助。我们也感谢埃蒙·博士宣读了他对手稿的评论。我们感谢我们的资助机构: 威康信托基金 [109854/z/15/z] 和皇家学会 [RG150216 到美联社]。
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |