多年生草试验中土壤、根际和根系微生物群落的分离与分析

1. 现场介绍 在收集期间描述实验现场站点。使用 GPS 确定域 (纬度、经度和高度) 的位置。 描述取样深度、取样时间和土壤质地。 环境因素对微生物群落的形成起着重要的作用。记录气候信息, 如年平均气温、年降水量、往年作物轮作、耕作做法、施肥方法和现场历史。自动气象站或其他设备是有用的记录每天的降雨量和气温在一个生长季节。 2. 土壤、根际和根场样品的收集和处理 植物的挖掘。 将洗涤盘和水桶贴上标签, 其中包含有关要取样的植物材料的信息。包括绘图号、植物基因型和植物种类等信息。将标签桶带到绘图区, 并将洗涤盘放在现场的固定工作站后面。 用铲子刺穿土壤, 深度为30厘米, 以切割在土壤中保持植物的任何侧根。近似体积为18厘米3。随机选择和收集两个植物每个情节从不同的区域内的情节。 利用铲子挖掘植物根系, 将根球放在标记的桶中。把被挖掘的根球带上标记的水桶回到现场的工作站。切断和丢弃地上植物的生物量。 从根部清除土壤和收集大块土。 摇动根部, 手动移除土壤或使用铁锹或手持的分蘖从根部去除土壤。摇动根部足以去除非常沙土中的土壤。在加工站附近戴上手套并放置根部。 摇根后, 土壤的大部分将在洗涤锅里。在洗涤盘中混合土壤, 用手持的分蘖分解任何泥土。将不含碎片的泥土样本放置在标签的 17.7 x 19.5 厘米拉链储存袋中, 放置在阴凉处或冰上。 根和根际的汇集。 使用修剪剪刀消毒在70% 乙醇, 消费的各种根, 大约4到6根每株植物和每个根约 9-12 厘米长度。将切除根 (切割所需的) 放置在含有35毫升蒸压的标签50毫升管中, 磷酸盐缓冲器 (6.33 克/升 NaH2PO4, 8.5 克/升 Na2HPO4无水, pH = 6.5, 200 µl/升表面活性剂)。注: 表面活性剂 (见材料表) 在热处理磷酸盐缓冲液后添加。根球的体积和根长度的变化取决于植物的年龄和植物种类。 摇管2分钟, 从根部表面释放根际。用镊子在70% 乙醇消毒, 去除根从管, 在纸巾上涂抹, 并放置在一个新的, 标记为50毫升管。把包含根际的管和含有根的管子放在冰上。 3. 实验室现场样品的处理 田间采集后根部的表面灭菌。注: 从现场返回后, 应尽快进行表面杀菌。如果不可能在同一天表面消毒根, 贮存根在4摄氏度, 直到处理。 添加大约35毫升50% 漂白剂 + 0.01% 吐温20到50毫升根管收集在该领域。摇动50毫升管30到60秒。倒入50% 漂白剂, 加入35毫升70% 乙醇。再摇30到60秒。 倒入70% 乙醇, 加入35毫升无菌、超纯水。摇1分钟。重复水洗两次。注: 为了确保我们的表面灭菌处理是足够的, 我们镀样品的水从上次冲洗和观察没有增长的细菌 (p. 王, 未发表的数据, 2014)。其他调查人员使用类似方法9、10测试了根杀菌效率。 在干净的纸巾上涂抹根干。对每个样品使用干净的纸巾。注: 纸巾在使用前可以消毒。我们不消毒纸巾。然而, 我们使用1纸巾每样品和保持毛巾包装, 直到使用。 使用无菌钳和修剪剪刀, 把根切成大约5毫米, 并将切割根部放在一个干净的, 标记为15毫升圆锥管。将样品贮存在摄氏-80 摄氏度, 直至进一步加工。 加工根际样品。 摇动50毫升管, 包含根际样品从田间并用重悬整个样品。使用无菌, 100 µm 网状细胞过滤器 (见材料表), 过滤悬浮样品到一个新的50毫升管。 在室温下离心管在 3000 x g 处5分钟。立即倒掉并丢弃上清。 将根际颗粒放在50毫升的冰管中。加入1.5 毫升无菌磷酸盐缓冲液 (不含表面活性剂) 到根际颗粒和涡旋悬浮。 将悬浮液吸管到一个干净的, 标记的, 2 毫升的离心管。在室温下, 旋转管在 15871 x g 处为2分钟。立即倒入上清, 并将管子排在干净的纸巾上。 将小球储存在-20 摄氏度, 直到进一步加工。注: 步骤 3.2.2-3.2.4, 以减少样品管大小的存储。与50毫升管相比, 存储较小的2毫升管的空间效率更高。 处理土壤样品进行 DNA 提取和土壤分析。 使用无菌金属铲, 填充一个干净, 标记2毫升管约3克的土壤 DNA 提取。避免任何小的根碎片和碎片。将土壤样品贮存在摄氏-20 摄氏度。在每个样品之间冲洗70% 乙醇金属刮刀。 在一个干净的洗涤锅里, 把泥土袋空成堆积的筛子 (见材料表), 在较小的筛子上方筛上较大的筛子, 并通过两个筛子手工筛选土壤。用刷子仔细清洗样品之间的筛子。 在 17.7 x 19.5 厘米的拉链袋中预留100到125克的被筛土壤, 用于未来土壤理化和纹理分析。将土壤袋放置在4摄氏度, 用于短期贮存。 土壤水分的土壤样品处理。 将一个标有褐色的纸袋包装在秤上。测量40到 45 g 被筛的土壤入褐色纸袋子。将棕色纸袋和土壤的重量记录在数据表上, 并将袋子放在烘干烤箱中, 设置为 55-60 摄氏度。 72小时后, 从烘干烤箱中取出袋子。让土壤袋冷却至少30分钟, 然后权衡。 要记录重量, 请将刻度减至零, 并将棕色纸袋放在刻度上。使用公式计算每个样品的土壤含水量百分比:注: 土壤水分法是从凯洛格生物站长期生态研究 (LTER)。知识库 LTER 为其网站上的研究人员提供了广泛的既定协议 (https://Lter.kbs.msu.edu/)。 4. 制备用于 DNA 提取的加工根样。 研磨冷冻根材料, 使样品均匀。 将液氮倒入塑料烧杯中, 用干净的铲子, 在干净的砂浆和杵中, 使样品在整个研磨过程中冻结。 将冷冻组织放入砂浆中, 用杵研磨成细粉。不断地在研磨过程中添加液氮以保持样品冷冻。 用刮刀将地面组织放置在一个干净的, 标记为2毫升的管。存储在-80 摄氏度。 5. 96 井格式提取土壤和根际样品中的 DNA 将土壤样品装入96井板中。 用70% 乙醇和1% 漂白剂擦拭工作区域。在这些步骤中佩戴实验室手套。从-20 摄氏度的储藏中取出土壤样品, 并允许在冰桶中解冻。 从带有 DNA 提取试剂盒的96井萃取板上取下密封垫盖。将密封垫盖在2纸巾之间, 在不使用时保持清洁。为避免污染, 使用8井胶粘剂的 PCR 条覆盖96井萃取板12柱。 将一个不育的重量漏斗 (大小 SM) 在一个刻度上, 并将200到250毫克的土壤称量出来。注: 这些无菌漏斗在一侧扁平, 因此漏斗在鳞片上平整。漏斗被泥土填满, 直接放进井里。这种技术避免了样品的丢失, 减少了溢出, 防止了交叉污染。 要揭开萃取板的第一井, 小心地提起胶条, 将填充的称重漏斗的颈部放在适当的井中, 轻轻地将土壤样品引导到适当的井中。更换胶条盖好。 重复这个过程的每一个良好的板块, 使用一个新的, 不育漏斗为每个样品, 直到该板块填充。保留一个井空作为提取空白控件。注: 每个萃取板上都留有一个井, 作为负 (空白) 控制。对试剂盒试剂11中可能存在的污染物的控制。 在萃取板上更换密封垫盖, 并将该板材贮存在-20 摄氏度, 直到准备好进行 DNA 提取。 将根际样品装入96井板中。 从-20 摄氏度的储藏中去除根际样品, 并允许在冰桶中解冻。 按照以上步骤5.1.2 准备 DNA 提取板。 将干净的纸擦在秤上, 然后将无菌金属铲抹在秤上。用刮刀小心地从样品管中挖出一些根际颗粒。把刮刀退回到鳞片上, 并在根际样品的200和250毫克之间称量。 小心地提起胶条, 揭开萃取板的第一井, 将填充的铲入井中, 用无菌牙签将根际物质刮入适当的井中。 在水中冲洗金属铲, 然后在样品间乙醇70%。对板块的每一个井重复这个过程, 直到盘子填满, 留下一个井空作为提取空白控制。 96井格式提取根际和土壤样品中的 DNA。 利用为土壤优选的试剂盒提取土壤和根际 DNA (见材料表), 遵循制造商的协议。注意: 我们使用这个特定的试剂盒来隔离土壤和根际 DNA, 因为专有试剂能够去除土壤中的腐植酸和其他功能强大的 PCR 抑制剂。 DNA 量化。 根据制造商的协议, 量化92样品和4浓度标准 (见材料表; 标准包括在内)。 根据制造商的协议, 将剩余的4个样品从盘子中取出, 以容纳四标准的水井 (见材料表)。 6. 从根样品中提取96井格式的 DNA。 将根样品装入96井板中。 用70% 乙醇和1% 漂白剂擦拭工作区域。在这些步骤中戴上手套。 把样品放在桶里, 放在干冰里, 保持地面根部的样品冻结。 用液氮填充塑料烧杯, 在塑料烧杯中放置抗静电 microspatulas 和无菌称重漏斗 (尺寸 XSM) 降温。 从带套件的96井萃取珠板上取下密封垫盖, 并将其放在2纸巾之间, 在不使用时保持清洁。注意: 此套件的更新版本, 在我们进行这些 DNA 提取的时间之后发布, 要求用户提供提取珠板。在材料表中, 我们列出了订购这些物料所需的供应商目录信息。 为避免污染, 使用8井胶粘剂的 PCR 条覆盖96井萃取板12柱。 将萃取珠板放在干冰上, 将样品保存在井中冷冻。 小心地提起胶条, 揭开萃取板的第一井, 将填充的称重漏斗的颈部放入适当的井中, 再加入3勺地根组织。更换胶条盖好。注: 在称重之前, 土壤和根际在冰上解冻, 而植物材料则被重冷冻。冷冻植物组织, 尤其是少量的, 很难在不解冻的情况下进行秤重。在基层组织进行了重量测试, 以确定有多少铲勺是足够的。请注意, 该套件的制造商不需要确切数量的组织, 但建议约50毫克. 不同的植物样本类型将有所不同, 用户将需要确定适当的数量。 对板块的每一个井重复这个过程, 直到盘子填满。 储存板在-20 °c, 直到准备 DNA 提取。 根组织的 DNA 提取。 根据制造商的协议, 用为植物优化的套件 (见材料表) 提取 DNA。注意: 我们使用这个套件专门为植物组织, 以达到最大产量从根样品。与土壤和根际不同的是, 腐植酸和其他污染物对根系组织的问题较小。 将 DNA 量化为步骤5.4。 7. 放大和测序分离的 DNA。 用证明阅读聚合酶 (见材料表) 放大16S 基因的 V4 区域, 如 Gohl等。12条码样品与不同的索引底漆和池排序前。序列使用 Gohl et al12描述的方法使用两步 PCR 过程与 V4 引物 (补充文件 1)。注意: 这些步骤的一些方法在其他12、13、14中详细描述, 因此不会在此描述。对于根样本, 添加肽拮抗剂, 以减少质 DNA 的数量从植物组织, 这已经被充分描述15。在测序中使用了两个控制, 一个负控制, 其中包括萃取板空白控制 (参见步骤5.1.5 后的注意事项), 以及已知细菌 DNA 种群的模拟社区 (见材料表), 作为一个积极的控制。注意: 在大多数情况下, MiSeq 试剂盒 v3 用于 2 X 300 基配对端模式。对于本手稿中的样品, Illumina HiSeq 2500 用于快速模式与250配对端 (2 x 250) 模式。所有样品都在同一条车道上测序。 通过管道进行微生物群落分析 (USEARCH v9.2.64、QIIME v1.9.1 和 RStudio v3.4.3 16) 处理测序数据。 使用 USEARCH17准备排序数据。注: USEARCH 可在线提供完整的说明 (https://www.drive5.com/usearch/)。 使用索引读取或条形码解排序数据, 以将 Illumina 读取分配给示例。 合并配对端读取以获得一致的序列。使用命令: usearch-fastq_mergepairs * R1 * fastq 重新标记备选 @ fastq_maxdiffs 10-fastq_minmergelen 230-fastq_maxmergelen 320-fastq_pctid 80-fastqout 合并。注意: 参数是通过引用 USEARCH 指令手册来设置的。 从测序数据中除去引物, 以避免在底漆序列中进行替代, 这可能是由 PCR 反应引起的。使用命令: usearch-fastx_truncate 合并. stripleft 19-stripright 20-fastqout 剥离。 过滤测序数据以去除低质量的读数并保持高质量的操作分类单元 (OTU) 序列。使用命令: usearch-fastq_filter 剥离. fastq_maxee 1.0-fastaout 过滤。 在 USEARCH 中生成 OTUs。 执行 dereplication 以标识唯一的 OTU 序列集。使用命令: usearch fastx_uniques 筛选 fastaout 独有 sizeout 重新标记备选。 群集 OTUs 与 97-100% 序列相似性, 以指定唯一的 OTUs。使用命令: usearch-cluster_otus 独有 minsize 2-otus otus 重新标记备选。注意: 此步骤还包括从群集 OTUs 中移除单克隆, 并将合体从排序数据中移除。 在 USEARCH 中创建一个 OTU 表。使用命令: usearch-usearch_global 被剥去. otus. 发线 + id 0.97-otutabout otutable.txt。注意: 此命令生成一个表, 其中每个示例的所有 OTUs 的读取次数 (计数) 数。OTU 表用于下游步骤, 包括差异丰度分析和微生物多样性分析。OTU 表的示例显示在补充图2中。 在 QIIME v1.9.1 18进行稀疏分析。注: 稀疏曲线是用 OTU 表计算的, 以确定测序的深度是否正确地取样了微生物群落。稀疏曲线的示例显示在补充图 3中。 进行阿尔法多样性分析18。在 QIIME v1.9.1 中使用 alpha_rarefaction 来计算每个样本中微生物群落的多样性。注意: 此分析计算多样性指数, 如香农19、辛普森20和 Chao121。 进行 beta 多样性分析18,22。使用 Python 脚本: beta_diversity_through_plots QIIME v1.9.1 Bray–Curtis 相异矩阵。注: 本分析比较了样品间的微生物群落组成。 对各组进行统计分析。使用 PERMONOVA 计算的距离矩阵, 使用阿尼斯和方差分析功能在纯素包装23 v2.4.5 在 RStudio16。使用纯素包装中的 capscale 函数对主坐标 (CAP) 分析进行规范化分析。在 RStudio 中使用 ggplot2 包24 v2.2.1 可视化数据。