बीटा-सेल कार्यक्षमता के लिए महत्वपूर्ण है रक्त-ग्लूकोज homeostasis, जो एकल सेल संकल्प में मूल्यांकन किया है कैल्शियम की आमद के लिए एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग रिपोर्टर का उपयोग कर ।
अग्नाशय बीटा कोशिकाओं हार्मोन इंसुलिन स्रावित द्वारा रक्त ग्लूकोज सांद्रता बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया. बीटा कोशिकाओं की शिथिलता hyperglycemia और गंभीर, जीवन के लिए खतरा परिणाम की ओर जाता है । समझ कैसे बीटा कोशिकाओं को शारीरिक स्थितियों के तहत काम और क्या आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के कारण उनके रोग मधुमेह रोगियों के लिए बेहतर इलाज के विकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हो सकता है । बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम का स्तर को मापने की क्षमता बीटा कोशिका समारोह का एक महत्वपूर्ण संकेतक के रूप में कार्य करता है, के रूप में कैल्शियम आयनों की आमद इंसुलिन रिलीज से चलाता है. यहां हम ग्लूकोज की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-zebrafish बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम को उत्तेजित GCaMP6s, कैल्शियम का एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर का उपयोग करके । विधि पूर्व vivo घुड़सवार टाप में एकल सेल संकल्प के साथ intracellular कैल्शियम गतिशीलता की निगरानी की अनुमति देता है । एक ही टाप के भीतर बीटा कोशिकाओं की ग्लूकोज-जवाबदेही अलग ग्लूकोज सांद्रता, जो zebrafish बीटा कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक विविधता की उपस्थिति का पता चलता है के तहत एक साथ कब्जा किया जा सकता है । इसके अलावा, तकनीक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प है, जो ग्लूकोज उत्तेजना पर कैल्शियम का तांता की थरथरानवाला प्रकृति से पता चलता है प्रदान करता है । हमारे दृष्टिकोण के दरवाजे को खोलता है एक मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के लिए बीटा सेल समारोह और शिथिलता के लिए आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के योगदान की जांच ।
हमारे रक्त-ग्लूकोज एक संकीर्ण रेंज में बनाए रखा है, अंत में स्रावी अग्ंयाशय के समारोह के कारण बड़े हिस्से में । अंत में अग्ंयाशय की भूमिका आइलेट्स, जो हार्मोन स्रावित कोशिकाओं को नियंत्रित की टाप द्वारा किया जाता है । इंसुलिन स्रावित बीटा कोशिकाओं एक कार्बोहाइड्रेट युक्त भोजन के बाद रक्त ग्लूकोज के स्तर को कम करने के लिए जिम्मेदार हैं. बीटा कोशिका से अपर्याप्त इंसुलिन स्राव मधुमेह1में परिणाम कर सकते हैं, जो निरंतर उच्च रक्त ग्लूकोज की विशेषता है. प्रकार 1 और प्रकार 2 मधुमेह, जो वर्तमान में ४००,०००,००० से अधिक लोगों को दुनिया भर में पीड़ित, रुग्णता और मृत्यु2की ओर जाता है । आणविक और पर्यावरणीय कारकों है कि बीटा कोशिका रोग में योगदान की जांच करके, हम बेहतर कैसे टाइप 2 मधुमेह शुरू होता है और प्रगति समझ जाएगा । इसके अलावा, मानव स्टेम कोशिकाओं में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता इन विट्रो में सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए नए बीटा कोशिकाओं के एक स्रोत प्रकार में प्रदान कर सकते हैं 1 मधुमेह. इस अंत करने के लिए, यह बीटा सेल समारोह और आनुवंशिक मॉडल जीवों में परिपक्वता का अध्ययन करने के क्रम में एक डिश में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं बनाने के लिए आवश्यक ज्ञान हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
बीटा सेल की कार्यक्षमता ग्लूकोज उत्तेजना के जवाब में स्रावित इंसुलिन की कुल मात्रा को बढ़ाता द्वारा पूरे-टाप स्तर पर नजर रखी जा सकती है । इस संचई दृष्टिकोण एक सेल के व्यक्तिगत गुणों में अंतर के बिना टाप कोशिकाओं के एक एकल समूह के रूप में अध्ययन । हालांकि, व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के ग्लूकोज प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण बीटा कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों में विविधता और3विविधता की उपस्थिति का पता चला. व्यक्तिगत बीटा-कोशिकाओं के समारोह का आकलन करने के लिए, यह intracellular परिवर्तन है कि इंसुलिन स्राव4के लिए नेतृत्व की निगरानी करने के लिए संभव है. इंसुलिन स्राव बीटा कोशिकाओं में ग्लूकोज की एक प्रविष्टि से पहले है. बीटा-कोशिकाओं में प्रवेश करने वाला ग्लूकोज एटीपी को तेजी से metabolized है । उच्च intracellular एटीपी सांद्रता बीटा सेल ध्रुवीकरण के लिए अग्रणी एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम आयन चैनलों की खुली संभावना में कमी । ध्रुवीकरण वोल्टेज के प्रति संवेदनशील कैल्शियम आयन चैनलों को खोलता है और intracellular कैल्शियम बढ़ जाती है । बारी में, कैल्शियम इंसुलिन की exocytosis चलाता है, जो परिसंचरण में जारी किया गया है और ग्लूकोज का स्तर कम करती है-उपयोग5,6,7।
कई रणनीतियों बीटा कोशिकाओं के समारोह की जांच करने के लिए लागू किया गया है, झिल्ली संभावित8की निगरानी सहित, इंसुलिन के प्रत्यक्ष दृश्य-बुलबुले exocytosis9, और intracellular Ca के ठहराव2 + ग्लूकोज-जवाबदेही10के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में आमद । उनमें से, intracellular Ca 2 के इमेजिंग+ का लाभ प्रदान करता है-एक ही टाप11,12के भीतर एकाधिक व्यक्तिगत कोशिकाओं को विश्लेषण स्केलिंग, के बीच ग्लूकोज की प्रतिक्रिया की सीधी तुलना के लिए अनुमति व्यक्तिगत बीटा-कोशिकाओं । Intracellular Ca2 + एकाग्रता कैल्शियम के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक13 या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs)14का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है । जबकि कैल्शियम-संकेतक रंजक कोशिका प्रकार विशिष्टता की कमी है, GECIs विशिष्ट प्रवर्तकों द्वारा एक विशिष्ट कोशिका प्रकार में व्यक्त किया जा सकता है । साथ ही, GECIs की नई जनरेशन, जैसे GCaMP6, तेज़ लौकिक dynamics15के साथ बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है । यहां हम GECIs की नई पीढ़ी की उपयोगिता का वर्णन, विशेष रूप से GCaMP6s में, एकल सेल संकल्प पर बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम की कल्पना । हम अपनी पसंद के मॉडल के रूप में zebrafish प्राथमिक टाप करने के लिए इस विधि लागू होते हैं । भ्रूण के विकास के दौरान, प्राथमिक टाप में बीटा कोशिकाओं पृष्ठीय और ventral अग्नाशय कलियों16से शुरू । प्राथमिक टाप zebrafish अग्न्याशय के भीतर एक टकसाली संरचनात्मक स्थिति पर स्थित है, अपनी आसान पहचान और अलगाव को सक्षम करने से । प्राथमिक टाप में बीटा-कोशिकाएं ग्लूकोज-नियमन के लिए आवश्यक हैं, क्योंकि उनकी आनुवंशिक पृथक hyperglycemia17,18की ओर जाती है । इसके अलावा, इन बीटा कोशिकाओं जल्दी zebrafish विकास19के दौरान ग्लूकोज उत्तरदायी हो. इस प्रोटोकॉल भी माध्यमिक टाप, जो बाद भ्रूण चरणों के दौरान फार्म इमेजिंग करने के लिए लागू किया जा सकता है । प्रोटोकॉल छवि बीटा-कोशिकाओं के पूर्व vivo, विकास के बाद के चरणों में और परिभाषित ग्लूकोज सांद्रता के तहत अनुमति देता है ।
यहाँ हम एकल सेल संकल्प पर बीटा सेल ग्लूकोज जवाबदेही के ठहराव के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन. इस intracellular कैल्शियम एकाग्रता का उपयोग कर एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक, GCaMP6s निगरानी द्वारा संभव बनाया है । बीटा सेल गतिविधि एक फाइब्रिनोजेन-thrombin मोल्ड में टाप बढ़ते द्वारा पूर्व वीवो कब्जा कर लिया है । प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम मोल्ड की स्थिरता है । फाइब्रिनोजेन को HBSS समाधान में भंग करने के लिए पर्याप्त समय दिया जाना चाहिए । इसके बिना, मोल्ड इमेजिंग सत्र के दौरान स्थिरता प्रदान करने के लिए पर्याप्त रूप से polymerize नहीं करता है । एक फाइब्रिनोजेन में घुड़सवार टाप-thrombin मोल्ड और सेल संस्कृति मीडिया में डूबे के लिए व्यवहार्य रह सकते है कम से एक सप्ताह (नहीं दिखाया डेटा) । फाइब्रिनोजेन-thrombin मोल्ड के लिए विकल्प, कम पिघल agarose के रूप में, टाप22माउंट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । एक अंय महत्वपूर्ण पैरामीटर टाप का विच्छेदन है । इस चरण के दौरान, टाप के आसपास के ऊतकों को घायल या poking के बिना बाहर निकाल दिया जाना चाहिए । एक निपुण विच्छेदन अभ्यास के साथ आता है ।
इमेजिंग प्रोटोकॉल की एक सीमा टाप के एक फोकल विमान के लिए प्रतिबंध है । यह व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम आमद की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए किया जाता है । टाप की पूरी मोटाई के माध्यम से एक Z-स्टैक कम इमेजिंग गति और व्यक्तिगत कोशिकाओं से थरथरानवाला संकेत के नुकसान की ओर जाता है । इस सीमा जैसे कताई-डिस्क माइक्रोस्कोपी, 3-आयामों में कैल्शियम गतिशीलता पर कब्जा करने में सक्षम करने के लिए के रूप में फोकल इमेजिंग का तेजी से मतलब का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है । एक अंय सीमांत vivo कैल्शियम इमेजिंग12 में होगा । zebrafish भ्रूण के पारदर्शी प्रकृति या वर्णक-zebrafish वयस्कों के कम उपभेदों के उपयोग के लिए भविष्य में vivo इमेजिंग में संभावना खोल सकता है ।
उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर बीटा सेल गतिविधि के इमेजिंग व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक विविधता की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है । इस दृष्टिकोण में मदद कर सकते है बीटा सेल उप के अस्तित्व पर प्रकाश डाला आबादी । हाल ही में, कई अध्ययनों ने नाममात्र समरूप बीटा कोशिकाओं24,25,26में उप आबादी के अस्तित्व को दिखाया गया है । पूर्व vivo इमेजिंग आनुवंशिक पत्रकारों के साथ संयुक्त किया जा सकता है ग्लूकोज के लिए उप जनसंख्या प्रतिक्रिया की विशेषताएं । इसके अतिरिक्त, औषधीय उत्तेजना के साथ इमेजिंग सेटअप के संयोजन यौगिकों कि बीटा सेल कार्यक्षमता में सुधार कर सकता है की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति दे सकते हैं ।
संक्षेप में, यहां प्रस्तुत तकनीक ठहराव और व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के लिए ग्लूकोज जवाबदेही की तुलना की अनुमति देता है । यह बीटा-सेल कार्यक्षमता, मधुमेह के विकास में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर में एक सीधी खिड़की प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Ninov लैब के सदस्यों को धंयवाद, अपक्षयी उपचार ड्रेसडेन (CRTD) मछली और तकनीकी सहायता के लिए सूक्ष्म सुविधा के लिए केंद्र के सदस्यों । N.N. DFG-CRTD, टू में उत्कृष्टता के क्लस्टर-ड्रेसडेन, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) और जर्मन मधुमेह अनुसंधान के लिए केंद्र (DZD) से धन द्वारा समर्थित है ।
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |