Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes

Alle procedures met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de Animal Welfare Act en met toestemming van de Landesdirektion Sachsen, Duitsland (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016). 1. voorbereiding Opmerking: Dit protocol is voor ex vivo beeldvorming van de primaire islet zebrafish van dubbele transgene Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); GS (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. In deze transgene lijn, de insuline-promotor (ins) rijdt de specifieke expressie bèta-cel van de twee transgenen: nls-Renilla-mKO2, die de kern van de beta-cellen met monomere Kusabira oranje 2 (mKO2) markeert fluorescentie; en GCaMP6s15, die stoot groene fluorescentie in reactie op de stijging van de intracellulaire calciumgehalte. De bèta-cel-specifieke uitdrukking van GCaMP6s kan bestuderen van het glucose-reactievermogen van de beta-cellen zonder inmenging van calcium veranderingen in het omringende celtypes. Bereiden van verse fibrinogeen voorraad (10 mg/mL) door het oplossen van 10 mg van boviene fibrinogeen in 1 mL Ca2 +/Mg2 +-met Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een centrifugebuis 1,5 mL. Vortex krachtig tot het fibrinogeen poeder lost volledig. Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten meer.Opmerking: De voorraad kan worden bewaard bij kamertemperatuur voor 2 – 3 h. negeren de voorraad als de oplossing begint te polymeriseren en viskeuze wordt. Bereid de fibrinogeen werkende oplossing (3.3 mg/mL) door verdunning van de voorraad van fibrinogeen drieledig in HBSS. Bijvoorbeeld, Meng 300 µL van fibrinogeen voorraad in 600 µL van HBSS te bereiden 900 µL van fibrinogeen werkende oplossing. Bereid trombine-oplossing (10 U/mL) door ontbinding 10 eenheden van trombine in 1 mL HBSS of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).Opmerking: Deze oplossing kan worden voorbereid, aliquoted in 50 µL delen en bevroren bij-20 ° C. 200 mM D-glucose oplossing voor te bereiden door het oplossen van 1,8 g van D-Glucose in 50 mL water. Houd in 4 ° C voor langdurige opslag. 300 mM KCl oplossing voor te bereiden door het oplossen van 1.1 g van KCl in 50 mL water. Houd in 4 ° C voor langdurige opslag. Aanschaffen van 35 mm diameter glas-onderkant gerechten voor de montage van de eilandjes. Gebruik voor de dissectie en de montage van het eilandje, een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentie lamp en rood filter kubus (TRITC: excitatie: 532 – 554 nm, emissie: 570 – 613 nm; of Texas-rood: excitatie: 540-580 nm, emissie: 592-667 nm). Voor de beeldvorming van de calcium instroom in bèta-cellen, gebruik een omgekeerde confocal microscoop (Zeiss LSM 780 of gelijkaardig) met 20 X (0.8 nvt) lucht doelstelling en uitgerust met een plaat houder voor de 35 mm diameter glas-onderkant gerechten. Voorbereiden op een 200 mg/L-oplossing van tricaïne methaan sulfonaat (MS222) euthanizing de zebravis. 90 mm petrischalen aanschaffen voor de zebravis dissectie. 2. de zebravis primaire Islet dissectie en montage Euthanaseren een vis langdurige incubatie met MS222. Voor dit, zachtjes verwijderen de vissen uit de vissentank met behulp van een visnet en Incubeer het in een petrischaal met de oplossing van de MS222 totdat het dier toont geen beweging van de operculaire (kieuwen); typisch, dit duurt 5 min. overdracht de vis naar een petrischaal met de HBSS oplossing met Ca2 +/Mg2 +. Ontleden onder een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentie lamp en een rood filter kubus, de huid die betrekking hebben op de rechterkant van de buik van het dier te isoleren van de alvleesklier. Snijd de huid van de zebravis van mond naar anaalvin met scherpe pincet hiervoor. Schil weg de gesneden huid blootstellen van de buik; Deze snipping bloot de interne organen. Met behulp van de rode fluorescentie van mKO2 expressie in de beta-cellen, gaan de locatie van de eilandjes door visueel onderzoek onder de Microscoop. Verwijder zo nodig de lobben van de lever, zoals zij betrekking op het rotseilandje hebben kunnen, waardoor het moeilijk te vinden.Opmerking: De primaire eilandje ligt in de buurt van de voorste regio van de buik, meestal aan de rechterkant. Reinig de primaire islet door het zorgvuldig verwijderen van omliggende weefsel zoals lever en adipocytes. Het nemen van voorzorgsmaatregelen niet te verwonden of steken van het rotseilandje; na verrekening van het omringende weefsel, worden de afzonderlijke cellen op het oppervlak van het eilandje waarneembaar. Pipetteer een druppel van de 30 µL van HBSS in het midden van een glazen-bodem schotel. De ontleed islet overbrengen in deze daling. Grondig wassen het rotseilandje eenmaal met HBSS en eenmaal met 30 µL van de werkoplossing fibrinogeen (3.3 mg/mL). Zorg ervoor om te voorkomen dat het drogen van het eiland tijdens de stappen wassen omdat het niet te doen leidt tot celdood. Voeg toe 10 µL van de trombine oplossing (10 U/mL) langzaam en voorzichtig. Ongewijzigd te laten het eilandje en de schotel voor 15-20 min. Let op dat de daling van de fibrinogeen-trombine viskeuze en enigszins dekkend op dit punt zal worden. 3. Ex Vivo wonen-imaging van GCaMP-intensiteit van de fluorescentie in Zebrafish primaire eilandjes Voeg 200 µL van HBSS op de top van de schimmel en zet de schotel voorzichtig aan de houder van de plaat van de confocal microscoop. Gebruik een 20 X 0.8 nb, lucht doelstelling voor confocal imaging. Zoek het eilandje met behulp van de optie helderveld. Met behulp van het filter voor rode fluorescentie te bekijken van de nucleaire mKO2-fluorescentie in beta-cellen, richten op het eilandje. Individuele kernen moet duidelijk zichtbaar zijn. Zoek een duidelijke imaging vliegtuig door handmatig het brandvlak van de confocal microscoop zodat het doorlopen van de dikte van het eiland langs de z-as te wijzigen. Ervoor zorgen dat de beeldvorming vliegtuig voldoende (50-100) van beta-cellen voor imaging bevat, en de helderheid van de nucleaire mKO2-fluorescentie uniform, met name in het midden van het eilandje is. Instellen van een sequentiële aanwinst voor GCaMP6s en mKO2 fluorescentie met behulp van de volgende instellingen in het “Smart configuratiemenu”: GCaMP6s, excitatie: 488 nm, emissie: 500 – 555 nm, onwaar-kleur: groen (Selecteer “GFP”); mKO2, excitatie: 561 nm (mCherry), emissie: 570 – 630 nm, onwaar-kleur: rood (Selecteer “mCherry”).Opmerking: Met deze instelling, het rode kanaal behaalt de positie van bèta-celkernen, terwijl het groene kanaal de intensiteit van de fluorescentie GCaMP behaalt. Resolutie van de afbeelding instellen op 1024 x 1024 pixels, snelheid op 10 en gemiddeld op 1 in de “overname Mode”. Geïnitieerde een continu opnemen door de optie voor “Time-serie” en de “duur” voor 500 cycli, met ongeveer 2 s overname keer per frame in te stellen.Opmerking: De eerste 50 frames van de tijd-serie overeen met de activiteit van de beta-cellen met glucose gehalte van 5 mM. Dit is de reactie van de basislijn. Een reagerende bèta-cel zal tonen wassende en afnemende in de intensiteit van de groene fluorescentie met tijd. Wij hebben geconstateerd dat een paar (1-5%) van de beta-cellen op 5 mM glucose oscilleren. Houd een oogje op de imaging cyclus. Na de eerste 50 frames, verhogen de concentratie glucose van de omringende oplossing tot 10 mM zonder het stoppen van de opname. Zonder storing veroorzaakt de Beeldacquisitie, zachtjes Pipetteer 5 µL van de 200 mM D-glucose oplossing op de top van de gel houden van het eilandje. Verwerven van 150 frames aan 10 mM glucose.Opmerking: De toename van de concentratie van glucose zal toenemen met het aantal bèta-cellen ondergaan GCaMP fluorescerende oscillaties in het groene kanaal. Erop toezien dat de kernen van de cellen stabiel tijdens het proces blijven. Als het eilandje te uitgebreid tijdens de overname schudden is en de kernen zijn verhuizen van het brandvlak, gooi het monster (indien nodig). Wacht een voldoende lange periode van polymerisatie van de schimmel fibrinogeen-trombine tijdig met het oog op de stabiliteit van de latere monsters. Bij 200 kaders, verdere verhoging de concentratie van de oplossing tot 20 mM door zachtjes pipetteren 10 µL van de 200 mM D-glucose-oplossing. Verwerven van 150 frames voor de concentratie van 20 mM. Depolarize na 350 frames, het eilandje met behulp van 30 mM van KCl. Voeg 20 µL van de 300 mM KCl stockoplossing hiervoor. In dit stadium, vaststellen dat de GCaMP6s fluorescentie oscillaties zal stoppen en met een hoge intensiteit repareren; beta-cellen die niet op glucose reageren kunnen ook een toename in groen-fluorescentie intensiteit op KCL toevoeging weergeven. 4. kwantificering van GCaMP fluorescentie Trace voor afzonderlijke Beta-cellen Opmerking: Als u wilt traceren en kwantificeren van de reacties van individuele beta-cellen op verschillende niveaus van de glucose, kwantificeren de intensiteit van de fluorescentie GCaMP voor de gehele periode van de beeldvorming. Kwantificering gebeurt in cellulaire resolutie. Hiervoor gebruik van FIJI20 om de intensiteitswaarden van de fluorescentie van de GCaMP uit de beelden (stappen 4.1-4.6), en de spreadsheet-software of de R21 voor het uitvoeren van de analyse (stappen 4.8 – 4,9). Open het afbeeldingsbestand in FIJI met behulp van de “LSM gereedschapskist”. Hiervoor selecteer “Plugin | LSM Toolbox | Toon van LSM toolbox”. In de “LSM werkset”, klik op “Open LSM” en selecteer het afbeeldingsbestand.Opmerking: Voor formaten niet ondersteund door de “LSM gereedschapskist”, converteren ze eerst tiff voor analyse. Pak de reacties van cellen met behulp van het hulpprogramma (ROI) regio-of-interest in FIJI. Open de “ROI-Manager” in het menu “Analyseren” onder “Tools”. Handmatig tekenen de ROI met behulp van de “selectiegereedschap veelhoek” gelegen in de werkbalk. Trekken de ROI in het rode kanaal waarin de kernen van de bèta-cel zichtbaar zijn. Selecteer de ROI zodanig dat het een oppervlakte groter is dan de kern van een cel om op te nemen sommige van het cytoplasma van de cel. Ervoor zorgen dat de positie van de ROI consistente tussen frames en de positie aanpassen indien nodig. De geselecteerde ROIs aan de “ROI-manager” toevoegen door te klikken op de knop “Add [t]”. Selecteren en toevoegen van meerdere ROIs aan de ROI voor het verkrijgen van gegevens over meerdere cellen. Vervolgens het menu “Analyseren” Selecteer “Set metingen”. Selecteer “Geïntegreerde dichtheid” voor het opgeven van de extractie van totale fluorescentie intensiteit binnen het gebied. Verschuiven naar het groene kanaal met de fluorescentie GCaMP en selecteer “Multi maatregel” in de “ROI-Manager”.Opmerking: Dit zorgt voor de intensiteit-metingen voor de cellen gedurende de tijd-serie. In het geval dat de positie van de ROI moet worden aangepast als gevolg van beweging van het eiland, handmatig compileren de metingen van de intensiteit in verschillende frames. Kopieer en plak de waarden naar een apart werkblad. De tijdstempels van de afbeeldingsframes verkrijgen “LSM gereedschapskist”. Gebruik “postzegels | T postzegels | Bestandsnaam | Dumpen naar tekstbestand’ voor de tijdstempels. Opslaan van tijdstempels met behulp van de optie “Opslaan als” of kopieer ze naar het werkblad. Bij het samenstellen van de intensiteitswaarden voor alle cellen, de analyse één cel tegelijk of automatisch (bijvoorbeeldmet behulp van Excel-formules of R) uit te voeren. Analyseren van afzonderlijke cellen in twee stappen. In de eerste stap, de intensiteit van de fluorescentie boven de basislijn worden berekend. Bereken de basislijn fluorescerende intensiteit (F0) als het gemiddelde van de fluorescentie intensiteiten voor de eerste 50 frames (5 mM glucose) te dien einde. Vervolgens aftrekken van de basislijn (F0) uit de hele tijd-serie (F-F0).Opmerking: een paar cellen prima overweg met duidelijke GCaMP oscillaties onder basale glucose, die meestal blijven na stimulatie met hogere concentraties. Voor dergelijke cellen is het alleen mogelijk om te schatten F0 door middel van de gemiddelde intensiteit van de initiële frames waarin de cellen een daling in de fluorescentie toonde. In de tweede stap van de analyse, de definitieve GCaMP fluorescentie intensiteit te verkrijgen door het normaliseren van de intensiteit van de fluorescentie.Opmerking: Dit is uitgevoerd om te verwijderen van de verschillen tussen eilandjes van verschillende dieren. Individuele eilandjes weer verschillende niveaus van fluorescentie emissie op glucose stimulatie. De intensiteit van de fluorescentie normaliseren door het onder te verdelen met de hoogste intensiteitswaarde. Hiervoor berekenen de piek intensiteit (Fmax -F0), en deelt u de basislijnwaarden afgetrokken door piek intensiteit aan het rendement van de uiteindelijke GCaMP fluorescentie intensiteit (F-F0) / (Fmax -F0). Gooi de cellen die niet een verandering in intensiteit na KCl stimulatie, vertonen als ze misschien wel ongezond of beschadigd. Voor het uitvoeren van de analyse (stappen 4.9-4.10) in R, het gebruik van het script van de R (plotcelltrace. R) voorzien van dit manuscript.