Нейросферы Assay для оценки активации эндогенного нервных стволовых клеток мыши модели минимальная травма спинного

Центральной нервной системы содержит субпопуляции самостоятельного обновления, Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые способны привести к возникновению всех различных Зрелые нейронных клеток типы^1,2,3,4. Эти нервные стволовые клетки (NSCs) проживают в специализированных нишах в мозг и спинной мозг и может быть активирован после травмы размножаться, мигрировать и дифференцироваться в зрелых нервные клетки. Было показано, что NSCs и их потомства мигрируют к месту травмы в кортикальной травмы модели^5,6. В головном мозге NSCs показали мигрировать из боковых желудочков на сайт травмы, где они дифференцируют в астроциты, которые способствуют глиальных шрам формирования⁷. В спинном мозге однако, было сделано несколько исследований спросить, если эти же эндогенных NSCs может быть использована для поощрения восстановления после травмы спинного мозга. Действительно в настоящее время дискуссии относительно того, требует ли активации стволовых клеток пула в спинном прямого физического ущерба перивентрикулярной ниши, накладки Центральный канал⁸ или если повреждения спинного шнур паренхимы (оставляя ствола клетки ниши нетронутыми) достаточно для того активировать эндогенного NSCs⁹.

Ряд моделей спинного травме (ТСТ) были использованы для изучения патофизиологии острые и хронические травмы. Эти модели также использовались для проверки потенциальных терапии для лечения SCI через нейропротекции, иммуномодулирующие и развивающихся клеток Трансплантация/замена стратегии^10,11,13. Текущие модели включают в себя сжатие или ушиба травм, которые вызывают крупномасштабных функциональных дефицита, а также обширные поражения и кавитаций в шнур^14,15. Результирующая глиальных шрамы могут охватывать несколько сегментов спинного мозга наряду с большинством ширина/окружности спинного¹⁶. Таким образом хотя эти модели являются клинически значимых, они могут позволить значительные проблемы для изучения реакции эндогенного NSCs после травмы. Существуют химические модели повреждений, которые могут быть адаптированы к привести к мягкой форм вреда, который может избавить Центральный канал¹⁷. Однако эти типы травм сосредоточить внимание на связанных с SCI демиелинизации и не являются клинически значимые модели для физические или механические повреждения, связанных с травматическим SCI.

Чтобы устранить ограничения текущей травмы моделей, мы адаптировали иглы трек минимальный SCI модель, первоначально разработанная в крыса⁹, для применения в модели взрослых мыши. Наша модель адаптирована травмы может создать последовательную поражением Дорсолатеральное региона спинного мозга мыши и запасных Центральный канал на Этажность травма. Преимуществом этой модели является, что она позволяет исследование кинетики НСК после травмы и их потенциальных радиальных миграции на сайт травмы. Использование мыши модели также допускает использование трансгенных мышей, которые позволяют линии отслеживания эндогенного NSCs и их потомства после травмы. Свойства NSCs, далее может оцениваться с использованием модифицированных формы в vitro нейросферы assay, который вводится в настоящем Протоколе.

Assay нейросферы является в vitro колонии формируя assay который позволяет изоляции NSCs присутствии митогенов. На клоновых обшивка плотности отдельных NSCs размножаться привести к свободно плавающего сферические колонии клеток, которые состоят из небольшой субпопуляции NSCs и подавляющее большинство прародителями^18,19. В нашем протокол, мы демонстрируем изоляции двух отдельных, линейный, связанных с NSCs из региона перивентрикулярной спинного мозга — в исходных условиях и после нашей минимальной SCI модели. Окончательным нервных стволовых клеток (dNSCs) Экспресс Нестин и глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и выращиваются в присутствии эпидермального фактора роста (EGF), фактор роста фибробластов (ФБП) и гепарина (совместно называемых EFH)²⁰. Эти dNSCs являются редкими в наивно спинного мозга, что приводит к очень мало neurospheres в пробирке. Тем не менее мы показывают, что dNSCs активируются после минимальной SCI, расширение числа neurospheres, изолированных от региона перивентрикулярной²¹. Примитивные нервные стволовые клетки (pNSCs) вверх по течению от dNSCs в линии нервных стволовых клеток. pNSCs являются чрезвычайно редки, Ускоренная низкий уровень плюрипотентности маркера Oct4 и лейкемия ингибирующего фактора (LiF) реагировать²². pNSCs не образуют neurospheres при изоляции от спинного мозга взрослого мыши вследствие наличия основного белка миелина (MBP) в первичных культур; Однако, ПНШК neurospheres могут быть изолированы от MBP несовершенным мышей и их численность расширенного следующие травмы — похож на dNSCs²¹. Наконец мы покажем, что dNSC производные neurospheres могут быть изолированы от сайта травмы в начале раз после минимальной SCI. Эти результаты демонстрируют, что наша модель травмы и анализов можно оценить характеристики активации перивентрикулярной NSCs как их способность размножаться и мигрируют в ответ на травмы.