Generation av första hjärtat fält-liknande hjärt stamfäder och ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna från mänskliga pluripotenta stamceller
Summary
Här beskriver vi en skalbar metod, med en enkel kombination av Activin A och lentivirus-medierad Id1-överuttryck, för att generera första hjärtat fält-liknande hjärt stamfäder och ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna från mänskliga pluripotenta stamceller.
Abstract
Generering av stora mängder funktionella mänskliga pluripotenta stamceller-derived hjärt stamfäder och hjärtmuskelceller definierade hjärtat fältet ursprung är en förutsättning för cellbaserade hjärt terapier och sjukdom modellering. Vi har nyligen visat att Id gener är både nödvändigt och tillräckligt att ange första hjärtat fältet föräldraparets under ryggradsdjur utveckling. Denna differentiering-protokollet utnyttjar dessa fynd och använder Id1 överuttryck i kombination med Activin A som potent ange ledtrådar för att producera första hjärtat fält-liknande (FHF-L) stamfäder. Ännu viktigare, differentieras resulterande föräldraparets effektivt (~ 70 – 90%) till ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna. Här beskriver vi en detaljerad metod för att 1) generera Id1-överuttryck hPSCs och 2) skilja skalbara mängder cryopreservable FHF-L stamfäder och ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna.
Introduction
Storskalig produktion av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs)-härledda hjärt stamfäder och hjärtmuskelcellerna är en förutsättning för stamceller-baserade behandlingar1, sjukdom modellering2,3 och snabba karakterisering av nya vägar reglerar hjärt differentiering4,5,6 och fysiologi7,8. Även om ett antal studier9,10,11,12,13,14beskrivit,15 tidigare högeffektiva hjärt differentiering protokoll från hPSCs, har ingen tagit upp hjärtat fältet ursprung resulterande hjärtmuskelceller, trots identifiering av betydande molekylära skillnader mellan vänster (första hjärtat fält) och höger (andra hjärtat field) ventrikulär hjärtmuskelcellerna16 och förekomsten av hjärtat branschvisa medfödda hjärtsjukdomar; dvs, hypoplastisk vänster hjärta syndrom17 eller Högerkammarfunktion höger kammare dysplasi18. Således generationen av hjärt stamfäder och hjärtmuskelceller av definierade hjärtat fältet ursprung från hPSCs blir en nödvändighet för att öka deras relevans som terapeutiska och sjukdom modelleringsverktyg.
Protokollet bygger på den konstituerande överuttryck av Id1, en nyligen identifierade5 första hjärtat fält-ange cue som i kombination med Activin A, är både nödvändig och tillräcklig för att inleda cardiogenesis i hPSCs. Noterbart Cunningham et al. (2017) 5 Visa att Id1-inducerad föräldraparets särskilt uttrycka första hjärtat fältet (HCN4, TBX5) men inte andra hjärtat Fältmarkörer (SIX2, ISL1) som de genomgår hjärt differentiering. Dessutom visar författarna också att transgena möss embryon saknas hela Id familjen av gener (Id1–4), utveckla utan att bilda första hjärtat fältet hjärt progenitorceller, medan fler mediala och bakre hjärt stamfäder ( andra hjärtat fältet) kan fortfarande bilda, tyder därmed på att ID-proteiner är nödvändigt att inleda första hjärtat fältet cardiogenesis i vivo. Bekvämt, Id1-inducerad föräldraparets kan förvaras i fryst tillstånd och spontant differentieras till hjärtmuskelcellerna visar ventrikulära-liknande egenskaper, inklusive ventrikulär-specifika markörer (IRX4, MYL2) uttryck och ventrikulär-liknande handlingspänningar.
Här beskriver vi en enkel och skalbar metod för att generera första hjärtat fält-liknande (FHF-L) hjärt stamfäder och ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna från Id1 överuttryck av hPSCs. Ett viktigt inslag i detta protokoll är möjligheten att avskilja hjärt stamceller generation från efterföljande hjärtmuskelcellen produktion med hjälp av ett praktiskt frysförvaring steg. Sammanfattningsvis, detta protokoll Detaljer nödvändiga åtgärder för att (1) generera Id1-överuttryck hPSCs, (2) generera FHF-L hjärt stamfäder från hPSCs, (3) frysa resulterande stamfäder och (4) återuppta FHF-L hjärt stamceller differentiering och generera höganrikat (> 70 – 90%) slog ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna.
Protocol
Representative Results
Discussion
För framgångsrika differentieringar, se till att noga följa instruktionerna ovan. Dessutom här lyfter vi fram viktiga parametrar som starkt påverkar differentiering utfall. Innan du börjar en differentiering, följande tre morfologiska parametrar bör följas: en stam morfologi av hPSCsId1, en hög cellulära packning och en hög sammanflödet (> 90%) av kulturen på dag 0. I detta avseende optimal differentiering villkor skapas bäst av plätering dissocierade hPSCsId1 som enstaka celler och …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar av Colas lab för bra diskussioner och kritiska omdömen om manuskriptet. Denna studie stöddes av NIH/NIEHS R44ES023521-02 och CIRM disk2-10110 beviljar för Dr. Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
Referencias
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
