Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines
Summary
Nous décrivons ici une méthode évolutive, en utilisant une combinaison simple d’activine A et induite par le lentivirus Id1-surexpression, pour générer des premiers progéniteurs cardiaques de coeur comme champ et cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines.
Abstract
La génération de grandes quantités de pluripotentes humaines fonctionnels dérivés de cellules souches cardiaques progéniteurs et les cardiomyocytes d’origine champ défini de coeur est une condition sine qua non pour la modélisation de la maladie et les thérapies cellulaires cardiaques. Nous avons récemment démontré que les gènes Id sont à la fois nécessaire et suffisante pour spécifier la premières progéniteurs de champ de cœur au cours du développement des vertébrés. Ce protocole de différenciation s’appuie sur ces constatations et utilise Id1 surexpression en combinaison avec l’activine A comme puissants repères indiquant pour produire des progéniteurs de (FHF-L) premiers cœur comme champ. Ce qui est important, résultant des progéniteurs différencient efficacement (~ 70 – 90 %) dans les cardiomyocytes ventriculaires ressemblant. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour 1) générer Id1-surexprimant hPSCs et 2) se différencient des quantités évolutives des progéniteurs de FHF-L cryopreservable et des cardiomyocytes ventriculaires ressemblant.
Introduction
Production à grande échelle des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs)-dérivées de cellules souches cardiaques et les cardiomyocytes est une condition sine qua non pour les thérapies basées sur les cellules souches1, modélisation2,3 et la caractérisation rapide de la maladie nouvelles voies réglementant la différenciation cardiaque4,5,6 et physiologie7,8. Bien qu’un certain nombre d’études9,10,11,12,13,14,,,15 ont décrits précédemment très efficace protocoles de différenciation cardiaques de hPSCs, aucune a abordé l’origine domaine de cœur des cardiomyocytes qui en résulte, en dépit de l’identification des importantes différences moléculaires entre gauche (premier champ du coeur) et droite (second champ de coeur) cardiomyocytes ventriculaires16 et l’existence de maladies cardiaques congénitales par coeur domaine spécifique ; c’est-à-dire, hypoplasie du coeur gauche syndrome17 ou arythmogène dysplasie ventriculaire droite18. Ainsi, la génération des progéniteurs cardiaques et les cardiomyocytes d’origine champ défini de coeur de hPSCs devient une nécessité afin d’augmenter leur pertinence en tant que thérapeutique et outils de modélisation de la maladie.
Ce protocole repose sur la surexpression constitutive ID1, récemment identifié5 premier cœur en spécifiant le champ repère qui, en combinaison avec l’activine A, est nécessaire et suffisante pour initier cardiogenesis dans hPSCs. Notamment, Cunningham et al. (2017) 5 démontrent que les progéniteurs induite par l’Id1 spécifiquement premier champ de cœur (HCN4, TBX5) mais pas second marqueurs de champ de cœur (SIX2, ISL1) car ils subissent une différenciation cardiaque. En outre, les auteurs montrent également que des embryons de souris transgéniques dépourvus de toute la famille de gènes (Id1–4), de Id développe sans former premier cœur champ cardiaque progéniteurs, en plus des progéniteurs cardiaques médial et postérieur ( deuxième champ de cœur) peut encore former, ce qui laisse croire que les protéines Id sont essentiels d’initier une première heart champ cardiogenesis in vivo. Idéalement, les progéniteurs induite par l’Id1 peut être cryoconservés et spontanément se différencient en cardiomyocytes ventriculaires-comme caractéristiques, notamment de l’expression des marqueurs spécifiques ventriculaire (IRX4, MYL2) et potentiels d’action ventriculaire-like.
Nous décrivons ici une méthode simple et évolutive pour générer des premier cœur comme champ (FHF-L) cardiaques progéniteurs et cardiomyocytes ventriculaires ressemblant de Id1 sur-exprimant hPSCs. Une caractéristique importante de ce protocole est la possibilité de découpler la génération de progéniteurs cardiaques du cardiomyocyte ultérieures de production utilisant une étape pratique de cryoconservation. En résumé, ce protocole détaille les étapes nécessaires pour (1) générer Id1-surexprimant hPSCs, (2) générer des cellules souches cardiaques FHF-L de hPSCs, (3) cryoconservé progéniteurs qui en résulte et (4) reprendre la différenciation des progéniteurs cardiaques FHF-L et générer hautement enrichi (> 70 – 90 %) battant cardiomyocytes ventriculaires-like.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour les différenciations réussies, assurez-vous de suivre attentivement les instructions indiquées ci-dessus. En outre, ici nous mettons en évidence les paramètres clés qui influencent les résultats de la différenciation. Avant de commencer une différenciation, les trois paramètres morphologiques suivantes doivent être respectées : une morphologie de la tige de hPSCsId1, un compactage cellulaire élevé et une confluence élevée (> 90 %) de la culture au jour 0. À cet égard, des conditions opt…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Colas pour discussions utiles et critiques du manuscrit. Cette étude a été financée par le NIH/NIEHS R44ES023521-02 et CIRM DISC2-10110 accorde aux Dr Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
Referencias
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