Summary

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

Diese Studie bietet eine validierte und optimierte Verfahren zur Isolierung und Kultur menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen in Vitro Decidualization Assay durchzuführen. Darüber hinaus bietet diese Studie einer detaillierte Methode, um effizient Knockdown ein bestimmtes Gen mit SiRNAs in menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen.

Abstract

Die Differenzierung der menschlichen Stromazellen endometriumzellen (HESC) von Fibroblasten-aussehen in sekretorischen Dezidua ist eine Transformation, die für die Implantation des Embryos in die Gebärmutterschleimhaut der mütterlichen Gebärmutter erforderlich. Unsachgemäße Decidualization wurde als Hauptursache für die Implantation Scheitern und anschließende frühen Embryo fehl-gegründet. Daher ist das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Decidualization vorteilhaft zur Verbesserung der Rate der erfolgreichen Geburten. In Vivo Studien des künstlichen Decidualization schränken oft aufgrund der ethischen Dilemmata Humanforschung sowie translational Komplikationen innerhalb von Tiermodellen zugeordnet. Dadurch werden in-vitro- Tests durch Primärzelle Kultur oft genutzt, um die Modulation des Decidualization über Hormone zu erkunden. Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von HESC und anschließende künstliche Decidualization über die Ergänzung der Hormone, um die Kultivierung Medium. Darüber hinaus bietet diese Studie einer durchdachten Methode, um Zuschlag jedes Gen des Interesses durch die Verwendung von Lipid-basierte SiRNA Transfektionen. Dieses Protokoll ermöglicht die Optimierung der Kultur Reinheit sowie Produktausbeute, und die Fähigkeit, dieses Modell als eine zuverlässige Methode zu verstehen, die molekularen Mechanismen Decidualization, und der anschließenden Quantifizierung der nutzen maximieren freigesetzten Mittel durch decidualized Stromazellen endometriumzellen.

Introduction

Zwischen den Phasen der Menarche und Menopause unterziehen Frauen im gebärfähigen Alter Monatszyklen der Hormon reguliert endometrial Proliferation, Differenzierung und anschließende Vergießen in Vorbereitung auf die Schwangerschaft in einem Prozeß bekannt als Menstruation1 ,2. Solche körperlichen Änderungen des menschlichen Endometriums sind notwendig für richtige Embryos in der Gebärmutter Wand1. Veränderungen des Endometriums, morphologische und biochemische Anpassungen, einschließlich vermittelt während des Menstruationszyklus über Eierstockkrebs Steroid-Hormone Östrogen und Progesteron (P4)3,4,5. Innerhalb der proliferative (oder follikulären) Phase Ebenen präovulatorische Östrogen Anstieg, Einleitung Verdickung der Gebärmutterschleimhaut. Nach Eisprung fördert die sekretorische (oder luteal) Phase einen signifikanten Anstieg der P4-Konzentrationen induzieren die morphologische Transformation von Stromazellen endometriumzellen (ESC) von Fibroblasten-aussehen gerundet, epithelialen wie deziduale Zellen in einem Prozess, bekannt als Decidualization4,6. Unsachgemäße Decidualization wurde als Hauptursache für die Implantation Scheitern und anschließende frühen Embryo fehl-4,7,8gegründet. Daher ist es vorteilhaft, die Diagnose und Behandlung von frühen schwangerschaftverlust, Verständnis der molekularen Mechanismen, die Decidualization.

Derzeit werden mehrere Methoden genutzt, um die zugrunde liegenden Auswirkungen von Decidualization auf Stromazellen endometriumzellen untersuchen. In Vivo, die Maus Gebärmutter künstlich induziert werden können, für Decidualization durch mechanische Stimulation (z.B.Kratzer) oder Öl-Injektion in einem hormonell grundiert Gebärmutter-9. Deutlich von den Menschen, fördert diese synthetischen Stimulation die Differenzierung des uterinen Lumens durch das Aussehen der Blastozyste Präsenz, ein Schritt, der für die Einleitung des Decidualization in Nagetieren10,11erforderlich ist. Entsprechend, durch translationalen Komplikationen im Zusammenhang mit Tiermodellen und die ethischen Dilemmata rund um in-Vivo Studien am Menschen, Decidualization basierte Modelle sind am erfolgreichsten studierte in-vitro-.

In dieser Studie werden die Themen durch die Platzierung von anzeigen in beiden Englisch und Spanisch Lokalzeitungen rekrutiert. Themen als geeignete Kandidaten für diese Studie identifiziert werden gebracht zu einem Treffen mit der Forschungskoordinator, in denen eine vollständige Offenlegung der Risiken werden besprochen. Nach Bestätigung der ein vollständiges Verständnis der potenziellen Risiken wird Probanden Zustimmung in schriftlicher und mündlicher Form erreicht. Einwilligung schließt die Berechtigung (1) unterziehen Aderlass (2) langfristige Speicherung von ihrem Gewebe für die zukünftige Forschung und (3) zur Schaffung von Primärkulturen aus gesammelten Gewebemustern zustimmen. Nach Zustimmung erhalten Themen eine Form, in welcher zulässigen Selbstidentifikation der Rasse/Ethnizität und/oder das Recht auf Geheimhaltung abzuschließen. Ein anschliessender Besuch soll die Endometrium-Biopsie basierend auf das Thema Menstruationszyklus zu erreichen. Freiwillige, die zu dieser Studie rekrutiert die ethnische und rassische Demographie der Metropolregion St. Louis zu reflektieren, wie durch die Volkszählung 2012 dokumentiert und beinhaltete nicht die Beteiligung der gefährdeten Bevölkerung einschließlich Schwangere, Föten, Embryonen, Kinder unter 18 Jahren alt oder anderen gefährdeten Gruppen. Voraussetzungen für die Teilnahme an der Biopsie-Probe-Sammlung gehören (1) wird im Alter von 18-45 Jahre (2) mit regelmäßigen Menstruationszyklus (25-32 Tage) (3), die keine aktuelle Schwangerschaft oder hormonelle/intrauterine Vorrichtung Verhütungsmittel 30 Tage vor der Einschreibung (4) ohne aktuelle vaginale Infektion oder sexuell übertragbare Krankheiten (5), die keine aktuelle Antibiotika-Behandlungen, und (6) haben keine aktuellen abnormen PAP-Abstrich.

Im Rahmen dieser Studie menschlichen Stromazellen endometriumzellen (HESC) kultiviert und künstlich induziert in-vitro- Decidualization durch die Ergänzung der Hormone (Östradiol (E2), Medroxyprogesteron Acetat (MPA) und zyklische Adenosin zu unterziehen Monophosphate (cAMP)) auf das Medium. Bei dieser Methode wird der Grad der Decidualization basierend auf die Gesamtzahl der Tage der hormonellen Behandlung verändert. In Verbindung mit Zellskelett Neuordnung induziert hormonelle Supplementierung biochemische Anpassungen, die wie die deziduale Zellen sekretorischen Qualitäten2,4erleben. Die Expression von Genen Markenzeichen, wie Prolaktin (PRL) und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindendes Protein 1 (IGFBP1), kann genutzt werden, um zu bestätigen und zu quantifizieren, den Grad der HESC Decidualization5,12, 13 , 14. wichtiger ist, beweist auch die Lebensfähigkeit dieses Protokolls, spezifischen gen-Knockdown durchzuführen.

Protocol

Alle menschlichen Endometrium Biopsien gesammelt für diese Studie wurden erreicht von der Washington University in St. Louis, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie mit einer institutionellen Review Board (IRB) genehmigt schriftliche Einverständniserklärung. 1. Vorbereitung Bereiten Sie 500 mL 1 x Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) durch Zugabe von 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin, die Medien mit Flasche (weiter als HBSS + Medium verwiesen). 500 …

Representative Results

Decidualization in HESC Kultur Nach Isolierung, menschliche endometriale Stromazellen Zellen wurden zu einer Monoschicht-Formation mit 80-90 % Konfluenz kultivierten und induzierte für in-vitro- Decidualization durch die Behandlung mit 10 nM E2, 1 µM MPA und 50 µM cAMP (EPC). Morphologische Veränderungen in Vitro Decidualization zugeordnet wurden in Figur 1Avis…

Discussion

Die weiblichen reproduktiven Zyklus zeichnet sich durch einen Anstieg der Progesteron-Spiegel während der luteal Phase, so induzieren die Decidualization des ESC in Runde, epithelialen anmutenden sekretorischen Zellen3,8. Die Einleitung der Decidualization ist Art angewiesen. Beim Menschen tritt Decidualization spontan nach dem Aufstieg der Progesteron-Konzentration, während Mäuse Blastozyste Präsenz10,11</…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Materials

Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

Referencias

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Citar este artículo
Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

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