JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Визуализация амилоида β вкладов в человеческий мозг с матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации изображений масс-спектрометрия

Published: March 07, 2019
doi:
10.3791/57645
, , , , , ,
1Department of Life and Medical Systems,Doshisha University, 2Bruker Daltonics K.K., 3The Brain Bank for Aging Research,Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology, 4Graduate School of Brain Science,Doshisha University

Summary

Молекулярное воображение с матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации основе изображений масс-спектрометрия (MALDI-IMS) позволяет одновременное отображение нескольких аналитов в биологических образцах. Здесь мы представляем протокол обнаружения и визуализации белка амилоида β на ткани мозга болезнь Альцгеймера и Церебральный амилоидные ангиопатии образцов с помощью MALDI-IMS.

Abstract

Невропатология болезни Альцгеймера (AD) характеризуется накоплением и агрегирования пептиды амилоида β (значения) в внеклеточной бляшек головного мозга. Aβ пептиды, состоящий из 40 аминокислот, создаются из белков амилоида прекурсоров (APP), β – и γ-secretases. Значения наносится не только в мозговой паренхимы, но и в лептоменингеальных и церебральной сосудистой стенки, известный как Церебральный амилоидные ангиопатии (УГА). Хотя были выявлены различные значения пептиды, подробные производство и распространение отдельных значения пептидов в патологических тканей AD и УГА не были полностью учтены. Здесь мы разрабатываем протокол при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации основе изображений масс-спектрометрии (MALDI-IMS) на ткани мозга человека вскрытия для получения всеобъемлющей белка сопоставления. Для этой цели человека корковых образцы были получены от мозга банка в Токио Метрополитен Института геронтологии. Замороженные cryosections вырезать и переданы Индий Оксидно оловянные (ИТО)-покрытие стеклянных скольжениях. Спектры приобретаются с использованием системы MALDI с пространственным разрешением до 20 мкм. Синапиновая кислота (SA) равномерно наносится на слайде с помощью автоматического или ручного распылителя. С текущей технические преимущества MALDI-IMS типичный набор данных различных видов значения в пределах те же разделы мозг человека autopsied можно получить без конкретных зондов. Кроме того с высоким разрешением (20 мкм) изображений AD и головного мозга тяжелой УГА пример четко показывает, что Aβ1-36-Aβ1-41 были зачислены на лептоменингеальных судов, в то время как Aβ1-42 и Aβ1-43 были сданы на хранение в мозговой паренхимы как старческое налета (SP). Это возможно принять MALDI-IMS как стандартный подход в сочетании с клинической, генетические и патологических наблюдений в понимании патологии AD, CAA, и других неврологических заболеваний на основе текущей стратегии.

Introduction

Чтобы сделать диагностику и понимать патогенез нейродегенеративных расстройств, точное определение молекулярных патологических отложений имеет важное значение1. В ходе AD, значения производится сделать СФМ в мозговой паренхимы и хранение в сосудах задолго до болезнь начала2,3,4,5,6. В то время как Aβ1-42 является преобладающим пептида в SP AD мозги, другие варианты значения, такие как N-терминала или C-терминал усечены или изменение Aβs, также определены в затрагиваемых AD мозги7,8,9, 10. Полную картину из широкого диапазона значения видов в мозг человека, особенно с AD и Церебральный амилоидные ангиопатии (УГА)11, поможет ученым понять значения производства, метаболизм и осаждения.

Как классический подход невропатология иммуногистохимия (IHC) был наиболее убедительных метод, чтобы определить расположение Aβs в14,13,12,тканей мозга15. В общем ИГХ не может различать молекулы, когда несколько эпитопов сосуществуют одновременно. Напротив возникающих массы на основе спектрометрии протеомного анализа является ценным подход особенно для анализа различных видов значения в тканях мозга, которые не смогите быть продифференцировано с антитела16,17. Обычных массовых спектрометрии-анализ мозга лизатов и иммуно осаждают образцов не удается обнаружить незначительные значения пептидов и теряет распределения информации значения в ткани мозга.

В более ранних работах визуализации значения вкладов в мозг мыши успешно используя трансгенных животных модель AD, например APP23. Однако этот процесс по-прежнему нуждается в технических достижений для сравнения IMS и IHC отношении разрешение и чувствительность18,,19–20. Невропатология объявления должны быть изучены на человеческий мозг, и мы использовали технологию MALDI-IMS на ткани мозга человека вскрытия для получения всеобъемлющей белка сопоставления21. Для этой цели мы разработали протокол для расширенный тип масс-спектрометрии, которая имеет преимущества в своей быстротой, чувствительность и воспроизводимость.

Protocol

Здесь в Токио Метрополитен гериатрической больнице, которая обеспечивает медицинское обслуживание на базе общин для пожилого населения в Японии были собраны образцы тканей. Мозг вскрытие образцы, используемые в исследовании были зарегистрированы в мозг банк старение научных исследований (Просветляющим) с осознанного согласия родственников погибшего. Просветляющим утверждается Комитетом по этике Токио Метрополитен гериатрической больницы и Институт геронтологии. Для всех мозги, зарегистрированный в банке мозга мы получили письменное информированное согласие для их использования в медицинских исследований от пациентов или их семей. Пациенты были размещены в комнате холодно (4 ° C) в течение 2 ч после смерти для уменьшения посмертные изменения в мозге. Все методы, описанные здесь были одобрены Дошиша университета и мозг банка для старения исследований, Токио Метрополитен гериатрической больницы и Институт геронтологии. 1. Подготовка разделов ткани для IMS Обработка образцов ткани мозга человека autopsiedПримечание: Убедитесь, что шаг подготовки образца для МСМ сохраняет исходное состояние тканей. Избегайте загрязнения и посмертные изменения. Следующий шаг имеет решающее значение. Получите человека корковых образцов для IMS мозги, которые были удалены, обрабатываются и хранятся при температуре-80 ° C в течение 8 ч посмертных. Возьмите мозг образца от затылочной коре больных ад и возраст соответствием контроля21. Подготовка разделов замороженные ткани Вырежьте разделов ткани на криостата. Место проводящих Ито покрытием Микроскоп слайды стекла внутри криостата21. Теплый образцов мозга вскрытия от-80 ° C до-22 ° C внутри криостата. Присоедините новые одноразовые лезвия к криостат для каждого эксперимента. Всегда старайтесь использовать чистую часть лезвия. Положить замороженные вскрытие мозги на сцене вместе с небольшое количество октября соединения (достаточно для покрытия области Центральной сцене; см. Таблицу материалы). Выберите условия для тонких секционирование. Для IMS используйте толщиной 10-12 мкм для секций человеческого мозга. Для IMS и МГС, вырежьте пять-шесть секций от каждого образца ткани. Когда лезвие только начинает вырезать ткань, поверните колесо и «лицом» блок до тех пор, пока все ткани подвергается. Если есть небольшая полоска или слезоточивый через раздел, ждать немного больше в криостат, до тех пор, пока регулировка температуры автоматически фиксирует его. Граф несколько секунд до открытия уголка с ткани под. Немедленно Поместите кусочек ткани на стороне покрытая ITO стекла слайда. Оттепель на срез ткани, поставив палец под слайд на стороне Ито покрытием. Ткани будет прилипать к слайду; Убедитесь, что ткань является плоской, как с без морщин. Выполните этот шаг при комнатной температуре.Примечание: Носить перчатки, маски и Лаборатория платье, потому что человека образцы могут содержать биологических загрязнений. Когда все разделы были сделаны за день, чистить криостат, щетки и патроны с лабораторией салфетки и 200 мл 100% этанола. Ополаскивание разделов ткани Погружать образцы в 40 – 100 мл 70% этанол 30 s для удаления эндогенных липидов и неорганических солей. Использование стекла, окрашивание банку. Стирать образцы с 40 – 100 мл этанола 100% для 30 s, 40 – 100 мл раствора Карнуа на 3 мин, 40 – 100 мл этанола 100% для 30 s, 40 – 100 мл 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК) за 1 мин и 40 – 100 мл этанола 100% для 30 s. Использование стекла пятнать банку.Примечание: Карнуа решение является фиксатором, состоит из шести частей этанола, трех частей уксусной кислоты и одна часть хлороформ. Сухой в вакууме за 30 мин. Лечение в разделах ткани с муравьиной кислоты паров для лучшего ионизации значения белков от вскрытия тканей мозга Подготовьте слайд стекло духовки и инкубации использоваться для последующего испарения с 5 мл 100% муравьиной кислоты. Для достижения удовлетворительной кислотных обработок, сохранить влажность воздуха в инкубации стеклянную посуду на насыщенность уровне на протяжении всего этот шаг и поддерживать температуру 60 ° C. Место ткани слайды в стеклянную посуду инкубации избегая погружения в муравьиную кислоту и лечить за 6 мин. Возьмите оптические изображения образцов с использованием фильм сканера, сканера гель, или цифровой микроскоп и т.д. выполните этот шаг при комнатной температуре. Выравнивание оптического изображения образцов необходим, когда целевой образец помещается внутри инструмента. Обычно он не будет возможным признать разделе ткани под слой матрицы.Примечание: Наиболее удобный способ принимать оптические изображения является использование сканера office. Это хорошая идея, чтобы сохранить изображение в папке изображений хранения данных. Коррелируют с образцами оптических изображений, чтобы руководство знаки, которые видны как в оптическое изображение, так и под слой матрицы в оптической камеры. Самый простой способ заключается в месте по меньшей мере три коррекции жидкости марок вокруг образца до принятия оптическое изображение. Применение матрицы Подготовка матрицы решения В органических растворителей терпимо Микропробирка, подготовить 10 мг/мл раствора SA в ацетонитриле (ACN) 50% и 0,1% TFA. Тщательно Растворите SA составные vortexing или краткий sonication 10 мин магазина решение при комнатной температуре до использования.Примечание: Существует три различных варианта для распыления матрица: с помощью аэрографа, Ультразвуковые распылители или автоматический спрейер. Опрыскивание матрицы с помощью аэрографа Выполните операцию при постоянной комнатной температуре (20 – 23 ° C) и влажности (40%-60%). Параметры для настройки оптимального распыления включают размер капли, туман, угол и расстояние между распылителя и Секцией ткани и Лаборатория температуры и влажности. Изменить эти условия, проверив результаты микроскопии.Примечание: Как ограничивающие факторы включают в себя размер кристалла и однородности покрытия матрицы и нежелательной миграции/диффузии аналитов, меньше лучше для размера капли. Однородность является также точкой инспекции. Опрыскивание матрица с ультразвуковой распылитель Удаление ткани, чтобы быть распылен из эксикаторе и поместите его в камере. Убедитесь, что ткань не перекрывает датчик окна. Начало подготовки, нажав кнопку Пуск ; времени приготовления пищи обычно около 90 мин. Подготовка будет регулироваться автоматически через мониторинг толщины слоя матрицы и сырости. После завершения подготовки удалить слайд и хранить его в эксикатор для 15 минут перед его чтением в инструменте MALDI. Очистите распылитель с 2 – 3 мл 100% метанола, пока не появится спрей голову очистки.Примечание: Штраф туман матрица капель допускается погружаться в ткани гравитационного листа. Размер Средняя капли 20 мкм генерируется; все диаметры капли являются менее 50 мкм. Опрыскивание матрица с автоматической опрыскиватель Распыляйте раствор матрицы на поверхности ткани с автоматической опрыскивателя. Постоянный поток газа с подогревом оболочка (N2, установлена на 10 psi и 75 ° C) будут осуществляться совместно с спрей решение матрицы. Используйте систему растворителя насоса (устанавливается на 10 psi и 0,15 мл/мин) Матрица решения.Примечание: Самое главное, работать под безопасности кабинета, чтобы избежать любых вдыхание аэрозолей матрицы. Контроль комнатной температуры и влажности для воспроизведения однородной матрицы кристаллизации. 2. MALDI-IMS Выполните сверхбыстродействующей масс-спектрометрии. Выполнить высок объём и высокое пространственное разрешение изображений эксперименты с MALDI-IMS с 10 кГц ND: YAG (355 Нм) лазер. Для измерения масс-спектрометрии Определите области ткани, с помощью программного обеспечения управления MALDI и программное обеспечение для анализа данных. Приобрести спектры в положительный линейный режим с массовых спектр m/z 2000-20000 и пространственным разрешением 20 и 100 мкм. Чтобы сделать калибровки стандартных, распустить пептид эталоном и белка-эталоном с соотношением 1:4 с альфа циано-4-гидроксил коричного кислоты (CHCA) в TA30 растворе (ACN:0.1% TFA = 30: 70) и затем разбавить его 10 x. Место 1 мкл калибровочных стандарт на слайде в четырех различных местах. Использование молекулярных гистология программного обеспечения (см. Таблицу материалы), наложение нескольких одного изображения, чтобы найти пространственной корреляции различных сигналов, таких как различные значения пептидов, colocalizing в СПС и артериальной стен. 3. обработка данных Для спектральных выравнивания выровняйте все спектры в список выбранных m/z от предыдущей публикации21. Импорт набора данных MALDI-IMS в программное обеспечение для статистического анализа (см. Таблицу материалы) с вычитание. Регионы интереса (ROI) на основании гистологического знаний трассировки. Выполнить анализ одномерных для средней интенсивности, стандартных отклонений, выявлении дискриминационных m/z маркеров (ROC-анализ), гипотез и открытие colocalized значения m/z. Создание карты сегментации. Выполните без присмотра многомерного анализа пространственной сегментации больших наборов данных и анализ компонентов для извлечения базовых тенденций. Выберите анатомические трансформирования, основанные на гистологических характеристик, например паренхимы и субарахноидальное пространство. Назначьте структур как отдельные трансформирования и соотнести их с обработанных данных MS для выявления связанных пептидов, которые позволили сегментации изображений региона.

Representative Results

Спорадические АД у больных с УГА (n = 5; средний возраст = 83,2 y) и возрасте предметы с старческое доска бесплатно (SP O) и УГА (n = 5; средний возраст = 77,2 y) были проанализированы (Таблица 1). УГА фенотипов пациента #3 были наиболее известных в этом исследовании. Распределение Aβ1-40 и Aβ1-42 депозитов в ткани мозга от пациента #3 были визуализированы с MALDI-IMS (рис. 1). Были без существенных сигналов в nonpathological управления мозги (пациенты #9 и #10), как показано на рисунке 1. Здесь MALDI-IMS четко визуализируется, что Aβ1-42 преференциально сдан как СФМ в мозговой паренхимы. Напротив короче Aβs, например Aβ1-36-1-41, преференциально были депонированы на лептоменингеальных сосудистых областях (рис. 1). Распределение Aβ40 и Aβ42 были дополнительно подтверждена с IHC использование прилегающих Замороженные разделы тканей. Антитела анти Aβ40 помечены УГА (стрелки на рис. 2B), который четко отличается от распределения Aβ42 в мозговой паренхимы как СФМ. Для Aβ1-41 мы первыми обнаружить этот фрагмент в человеческий мозг, и мы породили специфические антитела, которые могут дифференцировать Aβ41 от Aβ40 andAβ4221. Пространственное разрешение MALDI-IMS Обычно является наиболее важным фактором для быть улучшены. На рисунке 1 и Рисунок 2 Показать MALDI-IMS с разрешением 100 мкм шаг и получить общий профиль распределения для относительно широкую площадь21. Трудно определить амилоида осаждения ровно в субарахноидальное пространство, в том числе сосудистые структуры. Изобразить тонкой ткани структур субарахноидальное судов и поверхности коры, с высоким разрешением MALDI imaging (40 мкм: цифра 3; 20 мкм: Рисунок 4 и 5) была выполнена. В результате MALDI-IMS четко продемонстрировали, что короче Aβs, например Aβ1-36-1-41, распространяются в стенках артерий, что сопоставимо с МГС. MALDI-IMS продемонстрировал Подробное распределение Aβx-40 и Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 11pE) в AD, с умеренной УГА мозга. Например в то время как Aβx-40 видов показал аналогичный профиль распределения Aβ1-40, Aβx-42 видов показан шаблон другой дистрибутив с Aβ1-4221. Текущий протокол один Ион изображения отдельных значения пептидов, наблюдается с MALDI-IMS присваиваются значения видов. Напротив приобретенные изображения, которые данные могут быть исследованы с помощью многомерного статистического анализа без присмотра с целью получения сегментации изображений анатомических областей, представляющих интерес для дальнейшего анализа не определено белков. Рисунок 5 показывает карту сегментации, полученные с рассекает k средства анализа применительно к той же статьи21пациент #3. Этот метод кластеризации успешно определены налета подобных структур в паренхиме (синий цвет в рисунке 5 c) и сосудистых структур в субарахноидальном пространстве (зеленый цвет в рисунке 5 c). Это интересно найти небольшой круговой области в паренхиме, который обнаруживается только вокруг небольшой противовоспали паренхимы, а также в субарахноидальное пространство (фиолетовый в рисунке 5 c). Это подтверждается один Ион изображения этих отдельных значения пептидов в рисунке 5 d-5F. Рисунок 1: MALDI-IMS замороженных AD/УГА мозга разделе. Различные C-терминал усечение значения пептидов в AD, сопровождающих тяжелой УГА (пациент #3) отображаются в левой панели и элементы управления (пациент #9 на право и пациент #10 на все изображения слева) в правой панели. Aβ1-36-Aβ1-41 залегают преимущественно в лептоменингеальных кровеносных сосудов, в то время как Aβ1-42 и Aβ1-43 залегают в мозговой паренхимы как старческое бляшек в случае #3, хотя не было сигнала управления пациентов мозги (случаи #9 и #10). Резолюция = 100 мкм. Шкалы бар = 5 мм. Эта цифра была изменена с разрешения Какудский et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: MALDI-IMS замороженных AD/УГА мозг разделов и прилегающих затылочной коры от AD мозги. (A – C) замороженные разделы мозга AD/УГА и (D и E) смежные разделы затылочной коры от AD мозги были иммунной окрашенных и сосредоточена на артериолы и мозговой паренхимы, с использованием антител против Aβ40 (D: BA27) или Aβ42 (E: анти Aβ42 поликлональных). Оба анализы показали, что Aβ40 преференциально хранение в лептоменингеальных кровеносных сосудов (стрелки на панели D) и артериол в субарахноидальное пространство и мозговой паренхимы, образуя УГА. В противоположность этому Aβ42 главным образом на хранение в СПС. Для IMS, резолюции = 100 мкм. Шкалы бар = 5 мм (A, Bи C) = 5 мм, 500 (D и E). Эта цифра была изменена с разрешения Какудский et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: MALD-IMS замороженных AD/УГА мозг секции (пациент #3) с разрешением 40 µm. Различные C- и N-терминала усекается и изменение значения пептидов в AD сопровождающих тяжелой УГА (пациент #3). Aβ1-36-Aβ1-41 преференциально на хранение в лептоменингеальных кровеносных сосудов, в то время как Aβ1-42 и Aβ1-43 залегают в мозговой паренхимы как старческое бляшек. Масштаб баров = 1 мм (A-B), 2 (вверху слева). Резолюция = 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: MALDI-IMS замороженных AD/УГА мозг секции (пациент #3) с разрешением 20 мкм. Эта панель показывает различные C- и N-терминала усекается и изменение значения пептидов в AD сопровождающих тяжелой УГА (пациент #3). Aβ1-36-Aβ1-41 преференциально на хранение в лептоменингеальных кровеносных сосудов, в то время как Aβ1-42 и Aβ1-43 залегают в мозговой паренхимы как старческое бляшек. Масштаб баров = 200 мкм (a, b, c), 1 мм (вверху слева). Резолюция = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5: сегментация карта, получаемая MALDI-IMS замороженной секции мозга AD, показывает предполагаемые старческое налета, большой субарахноидальное судно структуры и малых Паренхиматозный артериол. (A) карта сегментации, полученные из анализа многофакторного изображения данных MALDI-IMS. (B) Bisecting k средства кластеризации анализа выявленных налета как и сосуд подобных структур в затылочной коре. Кластеры и каркасов и их отношения отображаются как узлы (e.g.,1-0-0). (C) различные значения пептид локализации шаблонов, напоминающих таблички (синий), субарахноидальное судов (зеленый) и структуры артериолы (красный). Обратите внимание, что несколько красных кластеров также распространяются в субарахноидальное пространство. Это подтверждается один Ион образы эти отдельные значения пептиды с разрешением 20 мкм: (D) значения 1-40, значения 1-41, (Е) и (F) значения 1-42. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Дело Пол Возраст в момент смерти Браак SP УГА 1 M 83 C 0.5 2 M 88 C 1 3 M 84 C 2 4 M 78 C 1 5 M 83 C 1 6 M 84 O 0 7 M 78 O 0 8 M 70 O 0 9 M 73 O 0 10 M 81 O 0 Таблица 1: клинические и патологические данные AD с УГА случаев и возрасте SP O предметов. Человека корковых образцов для IMS и МГС были получены из мозга банка в Токио Метрополитен Института геронтологии. Каждый мозг образец был взят из затылочной коры пяти пациентов AD и пять элементов управления, соответствует возрасту. Степени амилоида осаждения как показывает значения моноклональных антител определяется Браак SP (амилоид) этапов. На стадии O есть почти не старческий бляшки во всем isocortex. На этапе C страдают практически все области isocortical. Мозги AD неизменны на этапе C. Эта таблица была изменена с разрешения Какудский et al.21.

Discussion

Здесь мы продемонстрировали подробный протокол и результаты визуализации значения и его изоформы от нескольких autopsied мозги с AD и УГА с MALDI-IMS. Осаждения профиль Aβs резко изменилось с Aβ1-42 на его вариации N – и C-терминала. Aβ1-41 была впервые выявленных и визуализирована в человеческий мозг с нынешним протоколом и была дополнительно подтверждена с IHC21. Учитывая, что морфология хранение значения в IMS с высоким разрешением анализ (20 мкм) должны быть в хорошем согласии с МГС, IMS и IHC равной степени способствуют отличительные значения вкладов их расположение и содержание белка, а также их морфологии. Как описано здесь весь эксперимент проводился в затылочной коре, изучая локализация различных видов бета амилоида во всех регионах мозга будет обобщена с будущие эксперименты с использованием текущего протокола.

Важнейшие шаги в рамках Протокола являются шаги подготовки ткани для получения эффективной ионизации агрегированных белков в тканях мозга человека. Для поглощения лазерной энергии и побудить десорбции и ионизации аналитов требуется слой матрицы. В этом процессе Секция весь ткань покрыта однородно маленькие кристаллы. Однородная cocrystallization аналита с матрица имеет решающее значение для высокой чувствительности и артефакт свободных изображений. Каждый из трех спрей методов имеет свои преимущества. Покрасочная покрытие является одним из наиболее часто используемых методов. Аэрограф удобно; Однако это требует умелого операции. Как точные и воспроизводимые Экспериментальная техника имеет важное значение, рекомендуется использовать Ультразвуковые распылители или автоматическое распыление, как описано в текущем протоколов. Отношении ультразвуковой распылитель он будет не быть под влиянием влажности и температуры в помещении потому, что он является впрыскивается в камеру. Тем временем с автоматической опрыскиватель, получается относительно хорошо сохранившихся пространственное разрешение с хорошей воспроизводимостью. Как правило пространственным разрешением, полученные с трех методов увеличения порядка 1) распылитель, 2) автоматическое устройство и 3) Ультразвуковые распылители.

Самое главное этот протокол был первоначально создан для обнаружения и визуализации Aβs в мозг человека autopsied образцов. Визуализация Aβs с MALDI-IMS для APP23 мышей, который генерируется как животной модели объявления, основанные на шведском типа мутации человеческой приложения, ранее сообщал другими с существующего метода18,19. Однако бывший протокол применяется к APP23 не был достаточно, чтобы визуализировать значения его латеральное разрешение и чувствительность. Более ранних работах обсуждали, что высокие значения концентрации за пределами границ ткани являются явно артефакты в APP23 изображений с их протокол18,19. Это означает, что так называемые «пятно» между реальным СФМ и IMS изображения из-за добычи шаг матрицы было неизбежным с визуализации MALDI-типа. Однако в текущем протоколе, размытия исчез, и каждый спектра представлял каждый один SP в паренхиме мозга.

Как показано здесь, мы можем проследить Aβ1-41 для в первый раз в AD и УГА мозги MALDI-IMS, а также с МГС, с специфическим антителом собственного поколения21. Согласно модели обработки значения Aβ1-38 вытекает из Aβ1-45 через Aβ1-42, в то время как Aβ1-41, является производным от Aβ1-45, γ-secretase ступенчатой расщепления27,28,,2930,31 . Это означает, что текущий протокол поддерживает эту модель. Что касается ограничения этой техники мы должны учитывать неоднородность образцов от мозга человека вскрытия. Наиболее важным этапом, в некотором смысле, является оценка квалифицированных вскрытие мозговой ткани с этической доказательство. С нынешнего протокола в тех тканях мозга квалифицированных вскрытия MALDI-IMS индивидуально можно отслеживать весь распределение сложных молекул, имеющих несколько модификаций, а также неизвестных factor(s), регулирующих патогенеза AD, что еще предстоит определены. Кроме того в понимании общий патогенез различных невропатология в возрасте мозг человека, он должен быть возможным принять MALDI-IMS как стандартный подход, в сочетании с клинической, генетические и патологических наблюдений в неврологических заболеваний .

Еще один важный шаг MALDI-IMS является процесс интеллектуального анализа данных из полученного набора данных, который всегда много времени. Интеллектуального анализа данных вручную каждого пик распределения требует от пользователей, нажмите кнопку через каждое изображение и искать дистрибутивов, которые могут сопоставлять морфологии анализируемого образца. Автоматическая пространственных Сегментация может использоваться в качестве первого шага данных интеллектуального анализа, обеспечивая обзор набора данных и позволяя быстрое обнаружение характерных особенностей. В этом подходе статистически определяются сходства между спектрами данного региона, и аналогичные спектры группируются в один кластер. Все пикселы цветом согласно их назначение кластера (Рисунок 5). В настоящем исследовании AD/УГА область интересов является пространство значения осаждения в Паренхиматозный налета и субарахноидальное и Паренхиматозный сосудистых структур. Две отличительные пики, которые были дополнительно подтверждена с МГС были m/z значения из Aβ1-40 и Aβ1-4221. Таким образом это легко найти colocalized m/z с Aβ1-40 и Aβ1-42, который уже был аннотированный N – и C-терминал усеченного значения, а также неизвестные пептиды, для дальнейшего анализа.

Веллер и коллеги сообщили, что значения накапливается в стенах судна, более вокруг артерий, чем вокруг вен21. Кроме того было предложено, что межклеточной жидкости (ISF) включает в себя Aβs, экскретируется из мозговой паренхимы к лимфатических узлов через периваскулярной дренажные пути22,23,24,25 ,26. Текущий протокол для создания карты сегментации, основанный на наборе данных MALDI-IMS на 20 мкм резолюции поддерживает возможное существование периваскулярной дренажа путей головного мозга (рис. 5), которые в значительной степени способствовать ВГА в AD21 , 32. Кроме того, мы можем обнаружить маркер белки colocalized с налета и субарахноидальное сосудистую путем вычисления корреляции каждого значения m/z. В понимании общий патогенез различных невропатология в возрасте мозг человека, он должен быть возможным принять MALDI-IMS как мощный подход в сочетании с установленным данным ИГХ клинических, генетических и патологических наблюдений в неврологических заболевания.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа частично поддержали целевые субсидии для проведения научных исследований в инновационных областях (старение мозга белка и слабоумие управления 26117004; м.и. и т.м.). Это исследование, частично, было поддержано стратегической программы исследований для мозга наук от японского агентства для медицинских исследований и развития (AMED). Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами прибытия.

Materials

Cryostat Leica Microsystems, Wetzlar, Germany CM1950
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide Bruker Daltonics #237001
Blade (disposable) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany #117394
O.C.T. Compound Leica Microsystems, Wetzlar, Germany FSC 22 Blue
Scanner EPSON GT-980
Air-Brush GSI Creos PS274
Compressor MRHOBBY Mr.Linear compressor L5
Ultrasonic sprayer Bruker Daltonics ImagePrep
Automatic sprayer HTX Technologies TM Sprayer
Confocal-laser-scanning-microscope Carl Zeiss Inc. LSM 700
Ultra high speed MALDI instrument Bruker Daltonics rapifleX MALDI Tissuetyper
MALDI control software Bruker Daltonics FlexControl 3.8
Data analysis software Bruker Daltonics FlexImaging 5.0
Molecular histology software SCiLS, Bremen, Germany SciLS Lab 2016a
Statistical software SCiLS, Bremen, Germany SciLS Lab 2016a
Sinapinic acid (SA) Nacalai tesque 30494-91
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) Wako 037-19261
Calibration standard Bruker Daltonics
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Avidin and biotinylated HRP complex. Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA Vectastain Elite ABC kit
3,3-diaminobenzidine (DAB) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA Vectastain Elite ABC kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189 (2016).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
  3. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
  6. Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer’s disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
  7. Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
  8. Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer’s disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24 (2016).
  9. Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
  10. Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer’s disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
  11. Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
  12. Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
  13. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer’s disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
  14. Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
  15. Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
  16. Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
  17. Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer’s Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
  18. Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
  19. Stoeckli, M., et al. MALDI MS imaging of amyloid. Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).
  20. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
  21. Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73 (2017).
  22. Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
  23. Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
  24. Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
  25. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
  26. Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
  27. Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
  28. Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
  29. Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
  30. Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
  31. Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
  32. Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).

Tags

Amyloid BetaMALDI Imaging Mass SpectrometryAlzheimer’s DiseaseAutopsyFormic AcidSegmentation MapsMarker ProteinsPeptidesPlaqueSubarachnoid VasculatureCryostatITO-coated Glass SlidesEthanol WashVacuum Drying

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Ikegawa, M., Nirasawa, T., Kakuda, N., Miyasaka, T., Kuzuhara, Y., Murayama, S., Ihara, Y. Visualization of Amyloid β Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (145), e57645, doi:10.3791/57645 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image