Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels
Summary
Hier presenteren we een organotypic kweken protocol om te groeien van embryonale kip organen in vitro. Met deze methode kan de ontwikkeling van embryonale kip weefsel worden bestudeerd, met behoud van een hoge mate van controle over de omgeving van de cultuur.
Abstract
De embryonale kip wordt het meestal gebruikt als een betrouwbare modelorganisme voor gewervelde ontwikkeling. De toegankelijkheid en de korte incubatie maakt periode het ideaal voor experimenten. Op dit moment is de studie van deze ontwikkelings trajecten in het embryo van de kip is olv remmers en geneesmiddelen op gelokaliseerde sites en bij lage concentraties, met behulp van een verscheidenheid van methoden toe te passen. In vitro kweken van weefsel is een techniek waarmee de studie van weefsels gescheiden van het ontvangende organisme, terwijl gelijktijdig het omzeilen van veel van de fysieke beperkingen aanwezig bij het werken met hele embryo’s, zoals de gevoeligheid van de embryo ‘s hoge doses van potentieel dodelijke chemische stoffen. Hier presenteren we een organotypic protocol voor het kweken van de embryonale kip een half hoofd in vitro, die nieuwe mogelijkheden voor het onderzoek van ontwikkelings processen buiten de momenteel gevestigde methoden biedt te kweken.
Introduction
De embryonale kip (Gallus gallus) is een uitstekende modelorganisme gebruikte op het gebied van biologie. De incubatietijd is ongeveer 21 dagen en veel eicellen tegelijk kunnen worden geïncubeerd experimenten maken snel en efficiënt. Misschien belangrijkst, is het embryo ook gemakkelijk gemanipuleerd, waardoor de uitgebreide studie van belangrijke ontwikkelings processen en van de genen en eiwitten die deze processen drijven.
Het oog van de embryonale kip is een complex orgaan dat via de interactie van een aantal verschillende weefsels lijkt op veel andere lichaamssystemen ontwikkelt. Deze methode kan de studie van de ontwikkeling van deze weefsels, met name in geavanceerde stadia van ontwikkeling. Het multi-gelaagde netvlies kan bijvoorbeeld worden van bijzonder belang aan die het bestuderen van de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Alternatieve methoden waarmee de studie van andere weefsels van het oog zoals het hoornvlies, het lichaam van de vitreal, de lens, de sclera en de oogleden zijn van belang aan onderzoekers. Het kip embryonale oog bevat ook een reeks van platte botten, de scleral gehoorbeentjes, die kunnen worden gebruikt als een model voor de studie van intramembranous bot inductie en ossificatie in gewervelde dieren1.
Momenteel zijn er een aantal methoden die zijn gebruikt bij het bestuderen van de embryonale ontwikkeling. Microinjections van remmende antilichamen of andere remmende molecules2,3, chirurgisch geïmplanteerde microbeads gedrenkt in remmer4, en electroporation5 zijn alle methoden die kunnen worden gebruikt om downregulate genen of eiwitten van belang in een embryo. Soortgelijke methoden worden gebruikt om upregulate eiwitten. Deze methoden zijn niet zonder hun beperkingen. Bijvoorbeeld, wanneer het gebruik van chemische stoffen te wijzigen van de embryonale ontwikkeling, de letale effecten op het embryo moeten worden geëvalueerd, en dit beperkt het gebruik van de bovengenoemde methoden om gelokaliseerde websites van toepassing bij doses laag genoeg is om ervoor te zorgen het overlevingsvermogen van de embryo.
In vitro kweken van weefsel is gebruikt in een breed scala van organismen te bestuderen van ontwikkeling en kan worden gebruikt om sommige van de bovengenoemde beperkingen te omzeilen. Bijvoorbeeld, zijn de dijbenen6,7,8van de toppen van de veren en ledematen,9 van de kip alle bestudeerd met behulp van weefsel kweken methoden, evenals de teelballen van de muis10 en de wortels en stengels van planten11. Deze methoden geven wetenschappers een hoge mate van controle over de weefsel ontwikkeling, zoals de mogelijkheid te schommelen van de temperatuur en het veranderen van de beschikbaarheid van nutriënten. Het isolement van het weefsel van het hele embryo maakt het ook veel minder gevoelig is voor de letale effecten van chemische stoffen, waardoor manipulatie studies op wereldschaal bij hogere concentraties. Een ander opmerkelijk voordeel van in vitro kweken is de instandhouding van het weefsel van cellulaire omgeving; de rangschikking van weefsels blijft relatief ongewijzigd, waardoor het mogelijk is om te studeren van de interacties tussen de verschillende weefsel typen9. Dus, in vitro kweken opent deuren extra experimentele benaderingen niet beschikbaar in een in vivo of in ovo modellen.
Op dit moment vormt een bijzondere uitdaging voor het bestuderen van de ontwikkeling van het oog van de embryonale kip met behulp van chemische stoffen. Een aantal extraembryonic membranen betrekking hebben op het embryo, waardoor het moeilijk om toe te passen microbeads of chemische stoffen; het embryo is ook zeer actief binnen het ei als het ouder, verdere complicerende een toch al moeilijke methode. Dit protocol biedt gemakkelijk toegang tot het oog en de omliggende weefsels, opheffing van deze belemmeringen, waarbij ook nieuwe mogelijkheden te onderzoeken van de ontwikkelings processen in het oog. Dit protocol werd opgericht om te bestuderen van de inductie van de scleral gehoorbeentjes in het embryonale oog.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol maakt gebruik van gevestigde weefsel kweken van technieken om de groei van een oog van de kip van embryonale dag 8 (HH34) in vitro voor 4 dagen. Dit raster-kweken-methode werd oorspronkelijk beschreven door Trowell15. We een protocol van Pinto en Hall’s 1991 studie16 met behulp van een semi-poreuze membraan met het raster om te studeren inductieve signalen tussen de lagen van de gescheiden weefsel van de embryonale kip oog15geop…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) voor zijn voorbereidend werk in de ontwikkeling van het protocol. De auteurs ook bedank Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) voor zijn technische expertise en hulp bij het filmen en produceren van het audio/visuele deel van het manuscript. Daniel Andrews werd gesteund door de financiering van MSVU en de natuurlijke Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) via een Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal wordt gesteund door een subsidie voor de ontdekking van NSERC.
Materials
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
Referencias
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Biología del desarrollo. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Biología del desarrollo. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
