Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Cortical gabaérgica interneurônios (INs) são diversos em relação a suas propriedades bioquímicas, propriedades fisiológicas e conectividade, e eles medeiam funções diferentes em redes maduro^{1,2,3 ,4,5}. A especificação de diferentes subtipos de INs cortical é fortemente regulamentada através de cascatas genéticas que têm sido extensivamente estudados^1,2. A maioria (70%) cortical gabaérgica INs originam progenitores em medial Eminência ganglionar (MGE), uma estrutura embrionária localizada ventralmente e deve migrar através de distâncias relativamente longas para alcançar a placa cortical^{1, 2 , 6}. enquanto células piramidais corticais radialmente migram da zona ventricular (VZ) para a placa cortical ao longo do andaime glia radial, a migração tangencial do INs, que não estão conectados para tal um andaime, requer uma variedade de intrínsecos e extrínsecas pistas para atrair os neurônios migrando em direção a placa cortical, enquanto orientando-os longe de estruturas não-cortical^2,7,8. Depois de sair do ciclo celular, INs são repelidos desde a MGE por quimioterapia-repulsivo pistas expressas dentro o VZ da MGE, que desencadeia a migração tangencial em direção a placa cortical^9,10. Migrando INs evitar o striatum com o auxílio de diferentes pistas repulsivo¹¹ e, depois de atingir a placa cortical, eles alternar de um tangencial para um modo de migração radial e atingir a posição final laminar, em parte em resposta às sugestões do piramidal células¹² e outras populações celulares¹³. A migração do INs, quanto a outras populações neuronais, envolve várias mudanças morfológicas dinâmicas para permitir o movimento real do neurônio. Este so-called locomoção neuronal é caracterizada por ciclos repetitivos de três etapas sucessivas: o alongamento de um processo principal, um movimento ativo anterógrada do núcleo (nucleocinese) e a retração do processo à direita¹⁴. EM migração é regulada por numerosas pistas intrínsecas e extrínsecas que impulsionam a ramificação e remodelação ativo do processo principal para guiar o INs na direção correta, determinando tanto a orientação e a velocidade de migração^{14,15 ,16}.

Os determinantes de regulação cortical em migração têm sido muito estudados nos últimos anos^{1,2,7,17,18,19,20}, e perturbação em alguns desses atores molecular tem sido postulada para levar a distúrbios de desenvolvimento neurológico, como pediátrica refratário epilepsia ou autismo espectro transtornos^{1,2,21, 22 , 23 , 24}. por conseguinte, o desenvolvimento de diversas abordagens in vitro e in vivo tem sido exercido para avançar significativamente a nossa capacidade de estudar este processo dinâmico, como anteriormente analisados²⁵. Em vitro métodos, incluindo o ensaio de câmara Boyden e o ensaio de escolha de listra, fornecem os meios mais rápidos e mais reprodutíveis de avaliar a exigência e o impacto célula autónomos de genes específicos ou proteínas durante a migração neuronal, sem a influência de outros fatores,²⁵. Estes ensaios são particularmente úteis quando combinados com imagens live^8,26,27. Com estas técnicas, INs são facilmente obtido e13.5 MGE e isolado por dissociação enzimática e mecânica, após o qual podem ser investigados diferentes vias de sinalização e sinais de orientação, como ilustrado anteriormente^8,28 . No entanto, estes ensaios ocorrem em uma matriz extracellular artificial na ausência de arquitetura de tecido tridimensional, que pode alterar as propriedades de comportamento e célula neuronais, potencialmente afetando²⁵, de migração e/ou sobrevivência celular. Para contornar essas limitações, ex vivo MGE explantes foram desenvolvidos como uma ferramenta alternativa para quantificar as mudanças morfológicas dinâmicas que ocorrem durante a migração, juntamente com parâmetros como velocidade e orientação^{14, 29}. Geração de explantes MGE é relativamente simples e tem sido extensivamente descrito em outro lugar³⁰. Implica o chapeamento de um pequeno extracto da MGE em uma monocamada de células corticais mistas ou em uma mistura de matrigel e colágeno na presença de sinais atraente ou repulsivo²⁵, embora este último é opcionais³¹. MGE explantes permitem alta resolução de imagem de células escassamente rotuladas, simplificando o estudo de processos intracelulares, tais como a remodelação do citoesqueleto durante processo líder de ramificação, conforme mostrado anteriormente,^{32,33 ,34} e no presente estudo. MGE explantes foram usados com sucesso para avaliar alterações do citoesqueleto dinâmicas durante na migração em um ambiente 2D, por exemplo após manipulações farmacológicas ou Quimiotáticos específicas (ver, por exemplo, Tielens et al . 2016³³) . No entanto, com esta abordagem, INs migrar dentro de uma matriz artificial, e isso pode alterar no comportamento e a reprodutibilidade e o significado dos resultados experimentais.

Por outro lado, no utero electroporation permite a manipulação genética de INs no seu ambiente nativo e é um método amplamente utilizado para rapidamente e eficientemente a avaliar o impacto do ganho e perda de função dos genes ao contornar as limitações de knockout dispendioso e demorado e bater-se em estratégias de^25,35. Electroporation no utero pode ser inclinado para em progenitores utilizando factores específicos de tipo de célula e posicionamento dos eléctrodos para estruturas ventromedial, incluindo o MGE³⁶. Além disso, no utero electroporation permite a expressão oportuna de construções experimentais dentro de 1-2 dias, em comparação com os 7-10 dias necessários para construir a expressão usando viral vectores²⁵. No entanto, no utero eletroporação de em progenitores tende a ser baixo rendimento. Com efeito, apesar de progenitores de célula piramidal localizados na zona dorsal ventricular podem ser eficientemente transfectadas usando no utero electroporation, alvo localizadas ventralmente mais estruturas, tais como o MGE, é mais tecnicamente desafiador, especialmente em pequenas e13.5 embriões e a alta taxa de letalidade embrionária mais reduz o rendimento experimental²⁵.

Para contornar algumas das limitações técnicas associadas com in vitro MGE explant experimentos e na vivo no útero electroporation, ex vivo organotypic fatia culturas foram desenvolvidos^8,37,^{, 38,39}. Cérebro organotypic fatia culturas oferta condições a vantagem de imitar em vivo , apesar de ser menos caro e demorado do que animal gerando modelos²⁵. Com efeito, estas preparações permitem um fácil acesso para o MGE, juntamente com a visualização específica de INs e podem ser combinadas com eletroporação focal para investigar as vias moleculares específicas no INs migrando em um mais fisiológica de ambiente^{8 , 39 , 40 , 41}. otimizamos, portanto, uma abordagem por organotypic culturas³⁸, que nós combinamos com ex utero electroporation e imagem latente confocal lapso de tempo, ainda mais, avaliar o processo dinâmico e morfológico ocorrem durante a migração tangencial do MGE-INs. O presente protocolo foi adaptado e otimizado de outros que usaram para estudar a migração de células piramidais^42,43 ex utero ou no utero cérebro electroporation e organotypic fatia culturas e cortical INs^36,39,44. Especificamente, embriões do rato são decapitados e a MGE é electroporated ex vivo após a injeção intraventricular dos Plasmideos experimentais, permitindo mais eficientes e precisos segmentação dos progenitores MGE do que o que pode ser conseguido com electroporation no útero . O cérebro então é extraído e seccionados em fatias coronais do cérebro inteiro que podem ser cultivadas por alguns dias, permitindo assim contínuo monitoramento e imagem da INs transfectadas. Essa abordagem normalmente rotula INs tangencialmente migrando 5-20 por fatia do cérebro, minimizando o número de iterações experimentais necessária para alcançar significância estatística, enquanto rotular uma população neuronal suficientemente escassa para garantir a fácil separação de neurônios individuais para a reconstrução e a avaliação morfológica bem. Além disso, comparado a MGE explantes, culturas de organotypic garantir que migrando INs estão expostos a um ambiente mais natural, incluindo quimiocinas secretadas localmente e entradas de afferents talâmica. Esta abordagem é, portanto, adequada para quantificar a direcionalidade e migratório caminho adotado pelo INs transfectadas, oferecendo detalhes anatômicos suficientes para permitir a caracterização dos processos dinâmicos mais finas tais como principal processo de ramificação, nucleocinese e retração de processo à direita.