التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي
Summary
يمكن استخدام حقن إينتراسبينال recombinase تعتمد المؤتلف المرتبطة بالغدة الفيروس (راف) التعامل مع أي نوع من الخلايا المسمى وراثيا في الحبل الشوكي. هنا ونحن تصف كيفية ترانسدوسي الخلايا العصبية في القرن الظهري للحبل الشوكي القطني. هذا الأسلوب يتيح للاستجواب الوظيفي من النوع الفرعي العصبية التلاعب بها.
Abstract
التلاعب الانتقائي للعمود الفقري العصبية الفئات السكانية الفرعية قد تحقق أساسا بطريقتين مختلفتين: 1) علم الوراثة المتعدد الجوانب، حيث يتم إنشاؤها بضعفين أو ثلاثة إضعاف من الفئران المحورة وراثيا بغية تحقيق التعبير الانتقائي لمراسل أو المستجيب الجينات (مثلاً، من محور Rosa26) في السكان العمود الفقري المرجوة. 2) حقن إينتراسبينال المرتبطة بالغدد العرقية-تعتمد على فيروس المؤتلف (راف)؛ هنا يتم حقن ناقلات إف Cre-تعتمد على الترميز للجينات مراسل أو المستجيب للاختيار في الحبل الشوكي من الفئران معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية في يتدنى العصبية المطلوبة. هذا البروتوكول ويصف كيفية توليد نواقل راف تعتمد على لجنة المساواة العرقية وشرائح كيفية ترانسدوسي الخلايا العصبية في القرن الظهري للحبل الشوكي القطني L3-L5 مع رافس. كأجزاء العمود الفقري القطني L3-L5 هي معصب من تلك الخلايا العصبية الحسية المحيطية التي تنقل المعلومات الحسية من هيندليمبس، السلوك العفوي والاستجابات للاختبارات الحسية المطبقة على اللكتات عن إلى جانب الحقن يمكن أن تكون تحليله لاستجواب وظيفة الخلايا العصبية التلاعب في المعالجة الحسية. نحن نقدم أمثلة كيف يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل وراثيا تعريف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية في العمود الفقري. المزايا الرئيسية للتعبير التحوير الفيروس بوساطة لجنة المساواة العرقية الفئران المعدلة وراثيا مقارنة بالتعبير التحوير المستحثة بالماوس مراسل الكلاسيكية هي التالية: 1) يمكن أن تعتمد لجنة المساواة العرقية المختلفة رافس ترميز مختلف البروتينات مراسل أو المستجيب حقن خط المعدلة وراثيا Cre واحد، وبالتالي التغلب على الحاجة إلى إنشاء عدة الماوس المعدلة وراثيا متعددة الأسطر. 2) حقن إينتراسبينال يحد من التلاعب بالخلايا معربا عن لجنة المساواة العرقية للحقن والوقت بعد الحقن. المساوئ الرئيسية: 1) تعبير الجينات مراسل من رافس متغير أكثر. 2) مطلوب جراحة ترانسدوسي الخلايا العصبية العمود الفقري للفائدة. أي من هاتين الطريقتين هو الأنسب يعتمد على مسألة السكان وبحوث الخلايا العصبية معالجتها.
Introduction
الحبل الشوكي الظهرية ضروري لتبادل المعلومات بين أطراف الجسم والمخ. المنبهات الحسية مثل الحرارة، البرد، لمسة، أو يتم الكشف عن المنبهات الضارة بالخلايا العصبية الطرفية المتخصصة، التي تنقل هذه المعلومات إلى الخلايا العصبية للقرن الأفريقي الظهرية الحبل الشوكي. وهنا ينظم شبكة معقدة من إينتيرنيورونس المثبطة وضادات وفي نهاية المطاف مواقع مرحلات المعلومات الحسية عن طريق الإسقاط الشوكي من الخلايا العصبية إلى سوبراسبينال1،2. العمليات الحسابية التي تقوم بها العمود الفقري في جملة-وإسقاط الخلايا العصبية من بوابة المعلومات الحسية، وبالتالي تحديد المعلومات التي قمعت أو ترحيل بكثافة التي. التغييرات في التكامل للمنبهات الحسية، مثل إلى تغيير توازن بين تثبيط والإثارة، يمكن أن يسبب اختلالات حسية مثل فرط الحساسية أو اللودينيا (الأحاسيس المؤلمة بعد التحفيز عادة غير مؤلمة). ويعتقد أن السبب الأساسي للألم المزمن مختلف الدول3،4هذه التغييرات. وهكذا، العمود الفقري الدوائر ذات أهمية عالية في المعالجة الحسية، وبالتالي في إدراك البيئة الكائن الحي والنفس. مع ظهور الأخيرة وتركيبة الجزيئي، والوراثية، والتقنيات الجراحية التي تسمح للتلاعب بدقة للفئات السكانية الفرعية المحددة وراثيا العمود الفقري العصبية، العلماء الآن بدأنا نفهم الدوائر الأساسية العمود الفقري مسؤولة عن تجهيز طرائق حسية مميزة.
ضخ إينتراسبينال راف في الفئران البرية من نوع أو المعدلة وراثيا ساهمت إلى حد كبير إلى التلاعب، والتحليل، وفهم وظيفة من مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية العمود الفقري5،،من67، 8 , 9 , 10 , 11. يسمح هذا الأسلوب تقديم البروتينات علامة (مثل التجارة والنقل/البروتينات الانصهار بروتينات فلورية خضراء)، مراسل البروتينات (مثل جكامب)، أو البروتينات المستجيب (مثل السموم البكتيرية أو تشانيلرهودوبسين أو مستقبلات فارماكوجينيتيك) في مكانياً طريقة مقيدة للخلايا العصبية في العمود الفقري. ضخ رافس تعتمد على لجنة المساواة العرقية المحلية في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية في مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية العمود الفقري يسمح تحليل محددة من السكان الخلايا العصبية الخاصة بكل منها. وقد استخدمنا هذا الأسلوب في تسمية أو يجتذ أو تمنع أو تنشيط العمود الفقري جليسينيرجيك الخلايا العصبية مما يدل على أن تشكل جزءا أساسيا من العمود الفقري بوابة التحكم بالألم وحكة انتقال7. في هذه التجارب، مكن ضخ إينتراسبينال راف تعتمد على لجنة المساواة العرقية في الفئران GlyT2::Cre التلاعب جليسينيرجيك الخلايا العصبية في الحبل الشوكي القطني الانتقائي. وبالتالي يمكن تفادي التلاعب المتزامن للدوائر سوبراسبينال التي تحتوي على جليسينيرجيك الخلايا العصبية ذات أهمية حاسمة لبقاء الحيوان.
بينما حقن إينتراسبينال رافس يحد من العدوى إلى الموقع الحقن، يمكن أن يحدث توصيل الفيروسي ليس فقط في الخلايا العصبية المحلية ولكن أيضا في الخلايا العصبية التي تتصل بالحقن عن طريق الإسقاطات محواري. هذا الأخير غالباً ما يستخدم لتتبع مناطق الجهاز العصبي المركزي توفير مدخلات العصبية لنواة معينة في الدماغ. عدوى الإسقاطات محواري، ومع ذلك، يمكن أيضا عامل التباس عندما يقوم درس عدد محدد من الخلايا العصبية في موقع معين. لمعالجة هذه القضايا، وقد أجرينا مؤخرا تحليلاً شاملا للقاح إف وكاسيتات التعبير تحديد الأنماط والمروجين التي يمكن استخدامها إلى أما تصغير أو تكبير توصيل إلى الوراء. في سياق هذا البحث المحددة في العمود الفقري الدوائر، قمنا بتحليل قدرة اللقاح مختلفة والمروجين على ريتروجراديلي ترانسدوسي الخلايا العصبية في العقد الجذرية الظهرية (DRG)، ولب فينتروميديال روسترال (RVM)، وقشرة سوماتوسينسوري 12. ولذلك التقنية المبينة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحليل الخلايا العصبية العمود الفقري في موقع الحقن أو لتحليل الخلايا العصبية الإسقاط التي توفر مدخلاً إلى موقع حقن الحبل الشوكي. في البروتوكول هو موضح هنا، تجري ثلاث حقن راف في الجانب الأيسر من الحبل الشوكي القطني لتمكين توصيل الخلايا العصبية في ثلاثة أجزاء القطني (L3-L5). شرائح L3-L5 تلقي معظم المدخلات الحسية من اللكتات عن الحقن. ونحن تبين أن التلاعب الوظيفية للخلايا العصبية المسماة وراثيا في L3-L5 كافية لتثير التغيرات السلوكية قوية، وبالتالي توفير الأدلة الفنية للدالة حلبة لهذه الخلايا العصبية وراثيا المسمى نوع فرعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقن إينتراسبينال من آفس قد أصبحت تقنية قوية في مختبر لبحوث، مما يتيح تحليل خلايا العمود الفقري مع حل زمنية ومكانية عالية. هذا البروتوكول يمكن توصيل من ثلاثة أجزاء العمود الفقري الرئيسي معصب من الخلايا العصبية الحسية تمتد على محاور عصبية طرفية اللكتات. وتنتج ترانسدوسينج ثلاثة أجزاء البيا?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر هانز أولريتش زيلهوفير لسخاء في دعم هذا العمل. وأيد ويلدنير هندريك مؤسسة أولغا مايينفيش. ونحن نشكر كارمن بيرتشميير لجسم Lmx1b.
Materials
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) | Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
Referencias
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
