Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Het dorsale ruggenmerg is essentieel voor de uitwisseling van informatie tussen de periferie van het lichaam en de hersenen. Zintuiglijke prikkels zoals warmte, koude, aanraking, of schadelijke stimuli worden gedetecteerd door gespecialiseerde perifere neuronen, die deze informatie voor de neuronen van de dorsale Hoorn van het ruggenmerg. Hier, een complex netwerk van remmende en excitatory interneuronen moduleert en uiteindelijk de sensorische informatie relais via spinale projectie neuronen te supraspinal^1,2sites. De berekeningen uitgevoerd door spinale inter- en projectie neuronen gate zintuiglijke informatie, dus bepalen welke informatie wordt onderdrukt of doorgegeven bij welke intensiteit. Wijzigingen in de integratie van sensorische stimuli, zoals een gewijzigd evenwicht tussen inhibitie en excitatie, kunnen leiden tot sensorische stoornissen zoals overgevoeligheid of allodynia (pijnlijke gewaarwordingen na normaal niet-pijnlijke stimulatie). Deze wijzigingen worden beschouwd als dat de onderliggende oorzaak van verschillende chronische pijn staat^3,4. Spinale circuits zijn dus van groot belang zijn bij de verwerking van zintuiglijke en bijgevolg in de perceptie van een organisme milieu en zelf. Met de recente komst en combinatie van moleculaire, genetische, en chirurgische technieken waarmee de precieze manipulatie van genetisch geïdentificeerde spinale neuron subpopulaties, beginnen wetenschappers nu te begrijpen van de onderliggende spinale circuits verantwoordelijk voor de verwerking van de afzonderlijke zintuiglijke modaliteiten.

Intraspinal injectie van rAAV in wild-type of transgene muizen heeft bijgedragen aan de manipulatie, analyse en begrip van de functie van specifieke deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen^{5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11}. deze techniek maakt het mogelijk de levering van marker eiwitten (zoals GFP / GFP fusion eiwitten), verslaggever eiwitten (zoals GCaMP) of effector eiwitten (zoals bacteriële toxines, channelrhodopsin of Farmacogenetische receptoren) in een ruimtelijk beperkte wijze ruggenmerg neuronen. Lokale injectie van Cre-afhankelijke rAAVs in transgene muizen uiting van Cre recombinase in een specifieke subset van ruggenmerg neuronen kan de specifieke analyse van de respectieve neuronale bevolking. We hebben gebruikt deze techniek te etiketteren, lasertherapie, remmen of spinale glycinergic neuronen die aantonen dat zij zijn een essentieel onderdeel van de spinal gate beheersing van pijn en jeuk van transmissie⁷activeren. In deze experimenten, intraspinal injectie van Cre-afhankelijke rAAV in GlyT2::Cre muizen ingeschakeld de selectieve manipulatie van glycinergic neuronen in de lumbale ruggemerg. Gelijktijdige manipulatie van supraspinal circuits waarin glycinergic neuronen cruciaal voor de overleving van het dier kan worden vermeden.

Terwijl een intraspinal injectie van rAAVs infectie aan de plaats van injectie beperkt, kan virale transductie optreden niet alleen in lokale neuronen, maar ook in neuronen die verbinding met de injectieplaats via axonale projecties maken. De laatste wordt vaak gebruikt om trace CNS gebieden leveren van neuronale informatie aan een bepaalde kern in de hersenen. De besmetting van axonale projecties, maar ook kan een storende factor wanneer een gedefinieerde populatie van neuronen zal worden bestudeerd op een bepaalde site. Om deze kwesties te behandelen, hebben we onlangs een uitgebreide analyse van AAV serotypen en expressie cassettes te identificeren serotypes en initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om te minimaliseren of maximaliseren retrograde transductie uitgevoerd. In het kader van dit specifieke onderzoek in spinale circuits geanalyseerd wij het vermogen van verschillende serotypes en initiatiefnemers om retrogradely transduce neuronen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG), de rostraal ventromediale medulla (RVM) en de Somatosensorische cortex ¹². de techniek beschreven in dit protocol kan daarom worden gebruikt voor het analyseren van ruggenmerg neuronen op de injectieplaats of analyseren van projectie neuronen die inbreng op de ingespoten site van het ruggenmerg. In het protocol beschreven hier, worden drie injecties van rAAV in de linker kant van het lumbale ruggemerg uitgevoerd zodat transductie van neuronen in de drie lumbale segmenten (L3-L5). De L3-L5 segmenten ontvangen de meerderheid van de sensorische input het stuk ipsilaterale om de injectieplaats. Wij laten zien dat functionele manipulatie van genetisch gelabelde neuronen in L3-L5 voldoende te roepen robuuste gedragsveranderingen, waardoor het functionele bewijs voor de functie van de circuit van dergelijke een genetisch gelabelde neuron-subtype.