Måling av mitokondrie oksygenforbruk i Permeabilized fiber av Drosophila med minimale mengder vev

Frukt fly, Drosophila melanogaster, har blitt brukt som en modell organisme for genetisk forskning for tallet¹. Studiet av denne organismen har ikke bare ført til betydelige grunnleggende kunnskaper om sex-linked arv², mutasjon rate³, utviklingen av nevrale systemet og cellen skjebne besluttsomhet⁴, men har også nylig dukket opp som en verdifullt verktøy for å studere mekanismer ligger flere sykdommer som Alzheimers og Parkinsons^5,6. Videre er det en populær modell å studere aldringsprosessen, som de kan heves i mange over en kort periode og har en kort levetid. De har homologe strukturer til organer, som et hjerte, oenocytes (hepatocyte-lignende celler), fett organer (fungerer på samme måte som fettvev leveren og hvite), insulin produserende celler (tilsvarer β-bukspyttkjertelen celler), samt hemolymph transport metabolitter (analog til blodet av virveldyr)⁷. Videre er sentrale veiene av mellomledd metabolisme (inkludert insulin/insulin-lignende vekstfaktor-lignende signalveien og målet på Rapamycin-TOR veier) også høyt konservert⁷. For disse grunner, Drosophila har nylig blitt utnyttet for å beskrive de grunnleggende mekanismene som styrer metabolisme, spesielt i patologiske forhold iboende menneskelige metabolske sykdommer som diabetes⁸. En viktig komponent i stoffskiftet er mitokondrie som integrerer flere veier og utfører en av livets viktigste biologiske funksjoner, ATP produksjon, via oxidative fosforylering prosessen (OXPHOS). Vurderer deres sentrale rolle i organismes metabolisme er det ikke overraskende at mitokondrie dysfunksjoner er involvert i mange sykdommer som Parkinsons⁹ og Alzheimers sykdommer¹⁰og amyotrofisk lateral sklerose ^{11 , 12}. de er også grunnleggende determinanter av aldringsprosessen. Faktisk er de produsenter av reaktive oksygen arter (ROS) i cellen, som kan være skadelig for cellen i høy konsentrasjon til oksidative skader¹¹. Aldring har også vært knyttet til opphopning av skadet eller mutert Mitokondrielt DNA¹³, mitophagy dysfunksjoner^14,15 , samt verdifall mitokondrie biogenesis¹⁶. Mitokondrier er også viktige determinanter av cellens homeostase som de kan bruke ulike underlag for å justere flere cellulære funksjoner etter overflod eller mangel av makronæringsstoffer^17,18.

Faktisk er de ulike næringsstoffene i dietten (karbohydrater, lipider og proteiner) fordøyd, absorberes og transportert i cellene. De deretter transformeres i stoffer og avledede substrater transporteres inn i mitokondrie matrix der de produserer redusere ekvivalenter, som NADH og FADH₂¹⁹. Disse redusere ekvivalenter er deretter oksidert av ulike enzymatisk komplekser av elektronet transportsystem (ETS). Disse kompleksene er innebygd i mitokondrie interne membran, som kompleks I og komplekse II. I tillegg representerer andre enzymatisk komplekser som mitokondrie glyserol-3-fosfat dehydrogenase og proline dehydrogenase alternative ruter for oppføringen av elektroner i ETS^20,21. Disse “alternative” komplekser er spesielt viktig i insekter, som ifølge arter, de kan delta aktivt for å øke åndedrett^20,22,23,21. Elektroner fra disse ETS fôring systemer overføres til ubiquinone og senere til komplekse III, og deretter komplekse IV, før den endelige acceptor, molekylær oksygen. Denne elektron overføringen genererer en proton motiv kraft over interne mitokondrie membran kjører fosforylering av ADP til ATP på komplekse V (figur 1). Vurderer sentral rolle i mitokondrier i celle homeostase, studere mitokondrie metabolisme med relevante model D. melanogaster representerer et kraftig verktøy for å avgrense de underliggende mekanismene av ulike patofysiologiske betingelser eller under mobilnettet og miljømessige påkjenninger. Overraskende imidlertid målt bare en håndfull studier faktisk mitokondrie åndedrett i Drosophila^24,25,26. Eksperimenter sikte på å evaluere mitokondrie oksygenforbruk krever isolering av mitokondrier. Men en fordel for måling av forskjellige mitokondrie funksjoner (som ROS produksjon eller P/O forholdet som markør mitokondrie effektivitet^27,28), krever disse isolasjoner vanligvis ganske store mengder vev fra flere personer^24,29. Dette kravet for store mengder vev og enkeltpersoner er en viktig begrensende faktor, spesielt med tanke på at alle individer bør være på samme alder og fortrinnsvis av samme kjønn for eksperimenter, gjøre mål på åndedrett på ulike tidspunkt poeng arbeidskrevende i beste fall. Videre mens mitokondrie isolasjoner kan gi betydelig innsikt i grunnleggende mekanismer for mitokondrie metabolisme, har metodene som brukes til å isolere mitokondrier flere ulemper som er vanskelig å få repliserbar resultater , avbrudd i mitokondrie nettverket og endring av mitokondrie^29,30,31-med struktur og funksjon.

Målet med denne studien er å presentere en robust protokoll for å måle mitokondrie oksygenforbruk i Drosophila bruker bare en begrenset mengde av svært få individer. Denne protokollen består av måle mitokondrie oksygen forbruk i situ med permeabilized muskelfibre²⁹ fra Drosophila thoraxes i kombinasjon med høy oppløsning respirometry^{32,33, 34 , 35}. denne metoden har også flere fordeler sammenlignet med metoden klassiske mitokondrie isolasjon siden samhandling med andre komponenter cellen som vel som mitokondrie struktur og funksjon er mer bevart i permeabilized fiber^29,31,36, som gjør denne metoden mer fysiologisk relevant. Med denne protokollen, kan mitokondrie funksjoner nøyaktig evalueres med høy oppløsning respirometry i tre thoraxes i Drosophila, underlag slik at fastsetting av oksygenforbruk i flere forskjellige trinn av ETS. Derfor kunne denne protokollen hjelpe svar på viktige spørsmål om grunnleggende mekanismer som styrer forbrenningen i sammenheng med mange miljømessige eller patofysiologiske forhold ved å utnytte Drosophila modellen.

Å måle oksygenforbruk i flere forskjellige trinn av ETS og vurdere hvordan ulike underlag bidra til respirasjon, ulike underlag (figur 1), uncoupler og hemmere er brukt³⁰ etter permeabilization av den vev. Spesielt utføres sekvensielle filer av forskjellige underlag for å stimulere oppføringen av elektroner gjennom ulike komplekser av ETS. En uncoupler, karbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), deretter lagt på optimal konsentrasjon for å måle ikke-kombinert åndedrett, dvs. ikke-phosphorylating åndedrett stimulert til maksimalt oksygenopptak. Sekvensiell hemninger av komplekser I, II og III utføres da for å overvåke de resterende oksygenforbruk som skyldes ikke-ETS reaksjoner. Til slutt, komplekse IV maksimal åndedrett kapasitet kan evalueres ved injeksjon av N, N, N’, N – Tetramethyl – p-phenylenediamine (TMPD), en kunstig elektron leverandør og ascorbate. Det er viktig å merke seg at eksperimenter er gjennomført på 24 °C siden det er temperaturen som fluene er hevet.