قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، قد استخدمت ككائن نموذج للبحوث الوراثية لعلى مدى قرن¹. دراسة هذا الكائن لم يؤد فقط إلى المعرفة الأساسية الهامة حول الميراث المرتبطة²والطفرات معدل³، تطوير الجهاز العصبي و تحديد مصير الخلية⁴، لكنه برز أيضا في الآونة الأخيرة أداة قيمة لدراسة الآليات الكامنة للعديد من الأمراض مثل مرض الزهايمر وباركنسون^5،6. وعلاوة على ذلك، نموذج شعبية لدراسة عملية الشيخوخة، كما أنها يمكن أن تثار في عدد كبير خلال فترة قصيرة من الزمن ولها عمر قصير. كما أنها تمتلك هياكل مثلى للأعضاء البشرية، مثل قلب، oenocytes (مثل تتمثل الخلايا)، وهيئات الدهون (أداء المثل الأنسجة الدهنية البيضاء والكبد)، الأنسولين المنتجة للخلايا (ما يعادل الخلايا β البنكرياس)، فضلا عن هيموليمف نقل نواتج الأيض (يناظر دم الفقاريات)⁷. وعلاوة على ذلك، وسط مسارات الأيض الوسيطة (بما في ذلك مسار الإشارات الشبيهة بالانسولين/يشبه الأنسولين عامل النمو ومسارات الهدف ربمسن-تور) هي أيضا عالية حفظت⁷. لهذه الأسباب، استغلوا مؤخرا المورفولوجية لوصف الآليات الأساسية التي تتحكم في التمثيل الغذائي، خاصة في الحالات المرضية الملازمة للبشرية من الأمراض الأيضية مثل مرض السكري⁸. هو مكون رئيسي من الأيض ميتوكندريا يدمج مسارات متعددة ويقوم بواحدة من أهم وظائف بيولوجية للحياة، إنتاج ATP، عبر عملية الفسفرة (أوكسفوس). نظراً لدورها المركزي في عملية التمثيل الغذائي للكائن، فمن غير المستغرب أن خلل mitochondrial يشاركون في العديد من الأمراض مثل باركنسون⁹ والزهايمر من الأمراض¹⁰، وكذلك في التصلب العضلي الجانبي ^{11 , 12}-وهم أيضا المحددات الأساسية لعملية الشيخوخة. في الواقع، فهي المنتجة الرئيسية للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الخلية، والتي يمكن أن تكون ضارة للخلية عند تركيزات عالية من خلال الأضرار الأكسدة¹¹. كما ارتبطت الشيخوخة إلى تراكم الحمض النووي mitochondrial التالفة أو تحور¹³، ميتوفاجي الاختلالات^14،15 ، فضلا عن إعاقة نشوء حيوي المتقدرية¹⁶. الميتوكوندريا هي أيضا المحددات الرئيسية للتوازن للخلية كما يمكن الاستفادة من ركائز مختلفة لضبط العديد من الوظائف الخلوية حسب وفرة أو ندرة المغذيات الكبيرة^17،18.

في الواقع، المواد الغذائية المختلفة في الوجبة الغذائية (الكربوهيدرات والدهون والبروتينات) هي هضمها واستيعابها وتنقل في الخلايا. أنهم ثم تتحول في سيتوسول، وينقلون ركائز المشتقة في مصفوفة الميتوكوندريا حيث تنتج مكافئات الحد، مثل NADH والقوات المسلحة الهايتية₂¹⁹. ثم تتأكسد هذه المكافئات مما يقلل من مختلف مجمعات الانزيمية منظومة نقل الإلكترون (ETS). يتم تضمين هذه المجمعات في الغشاء الداخلي المتقدرية، مثل مجمع الأول و “الثاني المعقدة”. بالإضافة إلى ذلك، تمثل المجمعات الانزيمية الأخرى مثل نازعة والغليسيرول-3-الفوسفات mitochondrial ونازعه برولين طرق بديلة لدخول الإلكترونات في^20،ETS²¹. هذه المجمعات ‘بديل’ تتسم بأهمية خاصة في الحشرات، وفقا للأنواع، وأنهم يمكن أن تشارك بنشاط زيادة التنفس^20،،من^2223،21. يتم نقل الإلكترونات من هذه الاختبارات تغذية النظم إلى أوبيكوينوني وفي وقت لاحق إلى “الثالث معقدة”، ثم إلى “الرابع المعقدة”، حتى يقبلون النهائي، الأوكسجين الجزيئي. نقل الإلكترون هذا يولد قوة دافع بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية القيادة الفسفرة ADP إلى ATP في “مجمع الخامس” (الشكل 1). نظراً للدور المركزي الميتوكوندريا في التوازن للخلية، دراسة الأيض المتقدرية يمثل melanogaster دال- نموذج ذات الصلة باستخدام أداة قوية لتحديد الآليات الكامنة وراء مختلف الفيزيولوجية المرضية الظروف أو تحت تؤكد الخلوية والبيئية. المثير للدهشة ومع ذلك، سوى عدد قليل من الدراسات فعلا قياس التنفس المتقدرية في المورفولوجية^24،،من²⁵²⁶. وفي الواقع، تتطلب تجارب تهدف إلى تقييم استهلاك الأوكسجين المتقدرية عزلة الميتوكوندريا. على الرغم من فائدة لقياس وظائف المتقدرية مختلفة (مثل إنتاج روس أو نسبة P/O كعلامة لكفاءة الميتوكوندريا^،من²⁷²⁸)، هذه العزلة عموما تتطلب كميات كبيرة بدلاً من ذلك الأنسجة من عدة أفراد^24،29. هذا الشرط لكميات عالية من الأنسجة والأفراد عامل هام يحد، خاصة بالنظر إلى أن جميع الأفراد نفس السن، ويفضل أن تكون من نفس الجنس للتجارب، مما يجعل قياس التنفس في وقت مختلف يشير شاقة في أحسن الأحوال. وعلاوة على ذلك، بينما يمكن أن توفر العزلة المتقدرية كبير من التبصر في الآليات الأساسية التي تنظم الأيض المتقدرية، الأساليب المستخدمة لعزل الميتوكوندريا والعديد من العوائق مثل صعوبة الحصول على نتائج قابلة للتكرار ، تعطل شبكة الميتوكوندريا، وتحوير المتقدرية هيكل ووظيفة^29،،من³⁰³¹.

الهدف من هذه الدراسة تقديم بروتوكول قوية لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في المورفولوجية استخدام كمية ضئيلة فقط من الأنسجة من عدد قليل جداً من الأفراد. يتألف هذا البروتوكول من قياس الأوكسجين المتقدرية الاستهلاك في الموقع باستخدام ألياف العضلات بيرميبيليزيد²⁹ من ثوراكسيس المورفولوجية في تركيبة مع ريسبيروميتري عالية الدقة^{32،33، 34 , 35}-هذا الأسلوب له أيضا مزايا إضافية مقارنة بطريقة العزل المتقدرية الكلاسيكية نظراً للتفاعل مع العناصر الأخرى للخلية كما جيدا كما المتقدرية هيكل ووظيفة يتم الاحتفاظ أكثر في بيرميبيليزيد ألياف^29،،من³¹³⁶، مما يجعل هذا النهج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا. مع أحكام هذا البروتوكول، وظائف الميتوكوندريا يمكن دقة تقييم استخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس ثلاثة فقط من المورفولوجية، مع ركائز يسمح تحديد استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة من ETS. ولذلك، يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الإجابة على أسئلة رئيسية حول الآليات الأساسية التي تتحكم في عملية التمثيل الغذائي في سياق العديد من الظروف البيئية أو الفيزيولوجية المرضية بالاستفادة من نموذج المورفولوجية.

لقياس استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة ETS وتقييم ركائز مختلفة كيف تسهم التنفس، وركائز مختلفة (الشكل 1)، أونكوبلير، ومثبطات هي تستخدم³⁰ بعد بيرميبيليزيشن من الأنسجة. على وجه التحديد، يتم إجراء إضافات متتالية من ركائز مختلفة لتحفيز دخول الإلكترونات عن طريق مجمعات مختلفة من ETS. أونكوبلير، السيانيد الكربونيل 4–(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، ثم يضاف بتركيز الأمثل لقياس التنفس غير مقترنة، أي حفز التنفس غير فوسفوريلاتينج لاستهلاك الأوكسجين القصوى. متسلسلة من الموانع من مجمعات ثم تتم الأول، والثاني، والثالث لمراقبة استهلاك الأكسجين المتبقي الذي سبب تفاعلات أكسدة غير ETS. أخيرا، يمكن تقييم القدرة القصوى التنفس الرابع المعقدة بحقن N, N, N ‘، N، p-ميثيل–فينيلينيدياميني (تمبد)، موفر إلكترون مصطنعة، واسكوربات. من المهم أن نلاحظ أن هذه التجارب تجري في 24 درجةمئوية حيث أنها درجة الحرارة التي تربى الذباب.