O objetivo do presente protocolo é demonstrar a injeção intrabenigna de células de câncer de próstata, com posterior castração. Ortotópico modelos pré-clínicos de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração são críticos para estudar a doença no contexto de um microambiente do tumor clinicamente relevantes e um host imunocompetentes.
Modelagem de tumor ortotópico é uma ferramenta valiosa para pesquisa do câncer de próstata pré-clínicos, como tem várias vantagens sobre os dois subcutânea e geneticamente modificado geneticamente modelos do rato. Ao contrário dos tumores subcutâneos, ortotópico tumores contêm vasculatura clinicamente mais precisa, microambiente do tumor e respostas a várias terapias. Em contraste aos modelos do rato geneticamente modificados, ortotópico modelos podem ser realizados com menor custo e em menos tempo, envolvem o uso de mouse altamente complexo e heterogêneo ou linhas de células cancerosas humanas, prefiro que única alterações genéticas e estas células linhas podem ser geneticamente modificados, tais como express agentes de imagem. Aqui, apresentamos um protocolo para cirurgicamente, injetando uma linhagem de células de câncer de próstata murino luciferase – e mCherry-expressando no lobo anterior da próstata de ratos. Estes ratos desenvolveram ortotópico tumores que foram monitorados não invasiva na vivo e ainda mais analisaram para tumor volume, peso, sobrevivência de rato e infiltração imune. Além disso, ortotópico tumor-rolamento ratos foram castrados cirurgicamente, levando a regressão do tumor imediata e subsequente recorrência, representando o câncer de próstata resistente a castração. Embora a habilidade técnica é necessária para efectuar este procedimento, este modelo ortotópico syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração é de grande utilidade para todos os investigadores no campo.
Câncer de próstata é estimado para ter a maior incidência (161.360 homens) e causar a morte de terceiro-a maioria de câncer masculino (84.590 homens) em 20171. Após o diagnóstico, tumores da próstata são andrógeno-dependentes e são tratados pela prostatectomia cirúrgica, radioterapia e/ou terapia de privação do andrógeno (ADT), no entanto cada tratamento está associado a vários principais morbidades e complicações2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. regressão de tumor após ADT, apesar de quase todos os tumores reincidência como câncer de próstata resistente a castração (CRPC). Nesta fase, aprovadas terapias incluem docetaxel, imunoterapia Sipuleucel-T e a enzalutamide de pequenas moléculas anti-andrógeno abiraterone, ainda não há terapia individual confere uma vantagem de sobrevivência de mais de 5,2 meses11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. portanto, os homens em todos os estágios do câncer de próstata precisam tanto as opções de tratamento melhorado e gestão das morbidades, qual doença pré-clínica ideal de modelagem é crucial.
Com o procedimento correto, linhas de células de câncer de próstata podem ser cirurgicamente instiladas na próstata murino, levando ao desenvolvimento de ambos os tumores syngeneic ou xenogénica ortotópico. Modelagem de tumor ortotópico é ideal para todos os tumor biologia e drogas desenvolvimento pesquisa, permitindo desenvolvimento de tumor com um microambiente do tumor clinicamente representativa (TME). Estudos prévios demonstraram que tumores subcutâneos de (s.c.) tem uma vascularização do tumor alterado, levando a diferenciais e menos respostas clinicamente precisas para antiangiogênico terapias18,19. Além disso, vários estudos têm observado aumentada ou diminuição da eficácia de vários chemotherapeutics no tratamento da mesma linha de célula, dependendo se foi administrada s.c. ou orthotopically, o último dos quais melhor representado o que é visto em humanos câncer de21,20,22. Além disso, apenas em um modelo ortotópico de câncer de cólon, mas não no modelo s.c., tumores produzem as enzimas degradativos corretas necessárias para induzir a metástase23. Finalmente, como imunoterapias continuam a surgir na vanguarda da terapia do câncer, e especialmente como eles ainda têm que fornecer um benefício significativo para o câncer de próstata24,25, syngeneic modelos pré-clínicos com TME preciso e drenagem dos gânglios linfáticos em hospedeiros imunocompetentes são críticos.
Há muitos fatores responsáveis por estes resultados inconsistentes com base no local do tumor. Com uma altura diferente, as células cancerosas estão expostas a diferente endotélio tecido-específica e alteraram a angiogênese, afectando assim o tumor desenvolvimento26,27. Ortotópico tumores com o correto TME permitem a entrega da droga clinicamente relevantes, condições de hipóxicos e avaliação de antiangiogênico terapias28. Enquanto modelos geneticamente modificados (gemas) contêm um TME preciso, requerem tempo tempos para reprodução, custo elevado e são muitas vezes baseiam em manipulações de único ou poucos genes nocauteado ou overexpressed além níveis clinicamente relevantes. Em contraste, as linhas de células de câncer de próstata humano ou murino usadas em tumores ortotópico, como tumores humanos, são geneticamente muito mais complexas dentro de células individuais e na heterogeneidade entre células29,30de exibição. Também ao contrário de pedras preciosas, ortotópico linhas de células de câncer podem ser projetadas para expressar as modalidades de imagem ou aumento ou diminuição dos níveis de outras moléculas de interesse e in vitro e in vivo de resultados experimentais pode ser directamente comparado. Ortotópico tumores também podem ser formados de células derivadas de paciente primárias. Aqui, nós relatamos a metodologia para a realização de injeções intrabenigna de células de câncer de próstata que formam tumores de ortotópico andrógeno-dependentes e, após a castração, se repetirá como ortotópico CRPC.
Neste manuscrito descrevem o protocolo para efectuar injecções de células de câncer prostático intra cirúrgica. Utilizamos o andrógeno-dependentes e MYC –superexpressão (MYC superexpressão é visto acima de 80-90% de câncer de próstata humano39) linha de celular murino câncer de próstata, Myc-CaP, originalmente isolada da Hi-Myc rato32 ,33. Esta linha de celular foi estàvel transfectada para expressar tanto luciferase e mCherry, para não-invasivo na vivo de imagem tumor bioluminescentes e fluorescente, respectivamente. Castração cirúrgica, mais também foi realizada após o desenvolvimento do tumor andrógeno-dependentes, levando à regressão do tumor e posterior reincidência. Portanto, nós fornecemos detalhes para modelar tanto ortotópico câncer de próstata andrógeno-dependentes e CRPC em um host de imunocompetentes.
Células de Myc-CaP foram injetadas lobo anterior da próstata de ratos. A próstata de rato consiste dos lóbulos da próstata dorsolateral, ventrais e anteriores, e a próstata humana consiste em uma zona periférica, zona de transição e zona central dentro de um único lobo40. Enquanto estudos prévios anatomicamente e histologicamente compararam o lóbulo dorsolateral do mouse ao periférico humano de zona, o site da maioria dos cancros da próstata41e o lóbulo anterior do mouse para a zona central humano42, 43, mais recente e abrangente análise demonstrou que o lobo anterior e lobo dorsolateral exibem padrões de expressão de gene intimamente relacionadas, em comparação com o lóbulo ventral. 44 contínua, desenvolvimento de câncer de próstata tem sido observado no lobo anterior de gemas40, e, para o procedimento intraprostática, o lobo anterior permite a injeção do volume necessário de solução de célula de câncer com vazamento mínimo e variabilidade.
Usando s.c. e transgênica GEM modelos de câncer tem várias falhas e limitações. S.c. tumores cultivados em um TME artificial têm respostas diferenciais para quimioterapias, em contraste com os dois tumores ortotópico da mesma linha de celular e doença humana20,21,22. Isto pode ser devido a vasculatura alterada de tumores s.c., como exemplificado pela sua resposta diferencial para antiangiogênico terapia18,19. Pelo contrário, tumores ortotópico desenvolvem com uma adequada TME, drenagem dos gânglios linfáticos e vasculatura e podem ser executadas com linhas de células murino, permitindo desse modo também a análise de Imunologia do tumor e resposta a imunoterapias.
GEMs transgénicas desenvolvem tumores com uma adequada TME em um host de imunocompetentes, no entanto, estes modelos normalmente simplificar câncer humano através do desenvolvimento de tumores com única ou poucas alterações genéticas29. Uma análise de Myc-CaP e outras linhas de células de câncer de próstata revelou que contivessem muito maiores alterações de número de cópia somática e alterações cromossômicas do que tumores de ratos Hi-Myc e outras gemas do qual eles eram derivadas de29. Além disso, gemas são limitadas pelo aumento do custo e tempo necessário para os ratos de reprodução para realizar experimentos de alimentação suficiente. Modelagem de tumor ortotópico pode superar essas limitações. Linhas de células de câncer de próstata humano e murino contêm muitas alterações genéticas relevantes para doenças humanas29e, como câncer humano, mostram também grande heterogeneidade entre as células individuais de30. Ortotópico murino tumores syngeneic permitam análises imunológicas, enquanto ortotópico tumores xenogénicas humanas permitem análises da terapêutica em células humanas. Finalmente, ao contrário com gemas, célula linhas podem ser modificadas antes de injeção, permitindo a expressão de bioluminescentes ou fluorescente de moléculas de imagem para monitorar o crescimento do tumor, normaliza o fardo de tumor entre grupos experimentais, monitorar a resposta ao tratamento e a Siga a regressão do tumor e CRPC recorrência após castração cirúrgica.
Passos críticos neste protocolo incluem a localização e a externalização da vesícula seminal e anexado lobo anterior de próstata sem danificar outros tecidos ou perfuração da vesícula seminal, executando uma bem sucedida injeção intraprostática da 30 µ l de célula suspensão sem escapamento e coletando corretamente quaisquer fugas para prevenir o desenvolvimento de tumor não-ortotópico em todo o abdômen. A grande limitação de injecções intraprostática é atingir a habilidade técnica necessária para minimizar a variabilidade de tumor entre ratos. Isto é especialmente importante para a modelagem de CRPC, que tem a variável adicionada de castração cirúrgica. Intra-prostatically injetados e castrados ratos devem também ser seguidos de perto para recuperação e efeitos adversos, como eles foram submetidos a duas cirurgias de sobrevivência maior. Outra limitação é o momento de cada injeção intraprostática. Isto pode ser reduzido para baixo como 20 min, e o cirurgião assistente pode preparar o mouse próximo como o mouse atual é ser suturado. Finalmente, ortotópico Myc-CaP tumores são agressivos, crescimento rápido tumores que atingem o ponto de extremidade de sobrevivência em aproximadamente 46 dias (e logo em 35 dias) devido o tumor primário em massa. Estudos que exijam mais lento desenvolvimento de tumor ou tratamentos a longo prazo devem ser otimizados empiricamente para o regime de contagem e tratamento de célula injeção inicial. Em contraste com as limitações do s.c. tumores e pedras preciosas, todas as limitações acima do modelo ortotópico tumor podem ser superadas, e modificações adicionais do protocolo podem ser feitas com baseadas nas necessidades individuais de experimentais.
Como o ortotópico modelo tumor envolve o uso de in vitro-células manipuladas, estas células podem ser modificadas dependendo das necessidades do estudo. Aqui, nós modificamos a estas células para expressar estàvel luciferase e mCherry na vivo tumor monitoramento. Também efetuamos um nocaute CRISPR-Cas9 do supressor tumoral PTEN, para gerar uma linha de celular mais agressivo, clinicamente relevantes que cresce mais rápido como tumores ortotópico (manuscrito em revisão). Com as vantagens do modelo de tumor ortotópico, a capacidade de estudar o câncer de próstata andrógeno-dependentes e CRPC e o potencial para expressar as modalidades de imagem ou nocaute ou overexpress selecionados genes, este protocolo serve como um recurso valioso para todos pesquisa sobre o câncer de próstata.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenções de saúde Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Abdulkadir Sarki (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) e Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |