דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארות ב פרוטוקול זה הם שיש לבצע בדרישות תקנות אתיות ואת אישור של האוניברסיטה המתאים אכפת לי חיה מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC). 1. הכנת חומרים כירורגי, תאים סרטניים לפני יום הניתוח, החיטוי המספריים לנתח מיקרו, Graefe מלקחיים, מלקחיים רקמת Graefe, מחזיק מחט עם חותכי תפרים ולאחר מספר מתאים של וילונות. לחטא מזרק 50 µL ומחטים 28-מד על ידי גז אתילן אוקסיד (איור 1C). לפני יום הניתוח, התרבות תאים Myc-קאפ במנות 10 ס מ ב- RPMI בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) בחממה2 CO 37 ° C 5%. לניטור הגידול ביולומנאסן ו/או פלורסנט, transfect תאים 293T עם הווקטורים המתאים, לאחר מכן מגלי Myc-קאפ תאים עם מיקרומטר מסונן 0.45 lentivirus31. מיין תאים כדי ליצור קו תא יציב עם 100% התמרה חושית חיוביות.הערה: לבצע תרביות רקמה כל בתנאים סטריליים, וודא כי כל שורות תאים הם נטולי mycoplasma. הקו התא סרטן הערמונית מאתר מנוצל במחקר זה, כובע Myc32, transduced לבטא stably גחלילית לוציפראז והן mCherry. כובע Myc התא קו iss מבודד עם c-myc-overexpressing Hi-myc העכבר, ותאים אלה מכילים מוגבר של האנדרוגן (AR), אשר אנדרוגן תלויי32 ויוצרים גידולים CRPC לאחר סירוס מאתר33. עכברים כל במחקר זה הם עכברים FVB/NJ זכר שבוע 6-8. שורות תאים סרטן הערמונית מאתר חלופי יכול לשמש עם העכברים של הרקע הגנטי המתאים, כמו גם שורות תאים אנושיים של סרטן הערמונית או ראשי נגזר לחולה סרטן הערמונית תאים עם עכברים immunodeficient. המספר האופטימלי של תאים לכל זריקה צריך להיקבע מדעית עבור שורות תאים חלופי. בנוסף, חלופה הדמיה שיטות יכול להיות מנוצל כדי להמחיש גידולים, כולל דימות תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) או טומוגרפיה (CT), כמו גם ה-GFP, כחלופה mCherry. בלילה שלפני הניתוח, במקום matrigel קרום המרתף מטריקס וקרח נטולת פנול אדום על בגיל 4 ° C כדי להפשיר. ביום של הניתוח, לאסוף את התאים על ידי רחצתם בתמיסת פוספט buffered (PBS) וניתוק עם 0.25% טריפסין-EDTA. לנטרל טריפסין עם RPMI עם 10% FBS ו 1% P/S. Centrifuge התאים ב 400 g x במשך 5 דקות. לשטוף את התאים עם 10 מ”ל של RPMI ללא FBS או P/S. לספור את התאים, resuspend את התאים ב- PBS ב ריכוז של 6.67×107 תאים/מ ל (1 × 106 תאים/15 µL). הוסף אמצעי שווה של matrigel ליצירת השעיה תא PBS/matrigel 1:1 ב ריכוז סופי של 1 × 106 תאים/30 µL, לשמור את התאים על הקרח עד זריקה למניעת התמצקות.הערה: לבצע זריקות של הערמונית-“אינטרה” בתוך 3 שעות של הכנת matrigel תא המתלים. אם מבצע זריקות של הערמונית-“אינטרה” על עכברים יותר מ-5, חזור על השלבים שלעיל כדי להכין השעיה תא matrigel טריים. 2. שטרם-נותחו העכבר הכנה הערה: עכברים בבית אוניברסיטת בעלי חיים במתקן למשך לפחות שבוע לפני הניתוח כדי לאפשר הסתגלות נאותה וכדי לצמצם מתח בעלי חיים. צעדים 2.1-2.6 מבוצעים על ידי המנתח המסייע. כל ניתוח והשלבים מבוצעים על ידי המנתח באמצעות כפפות סטריליות וכלי ניתוח סטרילי טכניקה. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין (2-5% עבור אינדוקציה ויה קאמרית, 1-3% עבור תחזוקה דרך האף חרוט). ודא אינדוקציה מלא על ידי האובדן של הבוהן קמצוץ רפלקס. שוקל העכברים ולפקח לפחות 0.05 מ”ג/ק”ג של הבופרנורפין מאלחש ספורטינגהערה: העכבר משקל ≥ 20 g הינו אידיאלי עבור מוצלחת זריקות של הערמונית-“אינטרה”. משחה אופטלמולוגיות שימון חלות על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית. לגלח כל פרווה מהבטן. לעקר את הבטן על ידי שלושה סבבי יישום מעגלית של שיחים כירורגי באמצעות רפידות סטרילי ללא הקפדה, ואחריו מגבונים אלכוהוליים סטרילי. לאפשר את הבטן לייבש.הערה: עבור שאר הליך כירורגי, רק כפפות סטריליות, מכשירי ניתוח באפשרותך לפנות בבטן העכבר מעוקר. העבר את העכבר פרקדן על משטח נקי על כרית החימום ישירות תחת המטרה של מיקרוסקופ כירורגי נקי. מכסים את העכבר עם תלוי סטרילי עם חור קטן מעל הבטן. 3. אינטרה-הערמונית הזרקה הערה: בצע את כל השלבים כירורגי בתנאים סטריליים. התאמת המיקרוסקופ, מיקום העכבר או כל אובייקטים אחרים שאינו סטרילי חייב להיעשות על ידי המנתח המסייע. ביצוע כ 1 ס מ החתך של העור החיצוני לאורך הקו האמצעי של הבטן על הפין, בלוטות preputial (איור 1D). להפריד את רקמת החיבור בין בעור בטן החיצוני את מערכת השרירים הפנימיים של הבטן על-ידי פתיחת את המספריים בין השכבות. לבצע חתך דומה של מערכת השרירים הפנימיים של הבטן תוך שימוש מלקחיים להרים את מערכת השרירים כדי להימנע ניקב את המעיים או שלפוחית השתן (איור 1D). אתר אחד של שלפוחית הזרע הדו-צדדיים (איור 1A, לבן) / אונות הערמונית הקדמי (איור 1A, שחור), לעתים קרובות האחורי, לרוחב, מעט סופריור שלפוחית השתן (איור 1A, צהוב), אבל זה עשוי להשתנות בין עכברים . האונות הקדמיות הערמונית הם שקופים המחוברים למבנה המעוגל פחותה של שלפוחית הזרע לבן. הרימו בעדינות את קצה שלפוחית הזרע עם המלקחיים Graefe רקמות כדי ליצור מתח על הרקמה ללא ניקב את שלפוחית הזרע (איור 1E). לערבב את הפתרון matrigel Myc-קאפ על ידי אומות העולם pipetting (שבוצעה על-ידי המסייע המנתח), כמו תאים עשויים להיות מגורען, ואת לאט תשאף 30 µL (1 x 106 תאים) לתוך המחט כדי למנוע בועות אוויר. להוסיף בזהירות שיפוע של המחט במקביל לציר הארוך של האונה הערמונית הקדמי. לאט לאט להחדיר 30 µL לתוך האונה ומשכו לאט את המחט כדי למנוע דליפה (איור 1F). לאמת הזרקת נאותה על ידי engorgement של האונה הערמונית הקדמי (איור 1 ג’י). בזהירות להחזיק את שלפוחית הזרע מוזרק האונה הערמונית מחוץ העכבר עבור 30 s כדי לאפשר matrigel לגבש חלקית בתוך האונה. במהלך תקופה זו, לאסוף את כל דליפה פתרון תא בבטן באמצעות של פוליאסטר סטרילי משופעת המוליך למניעת התפתחות גידולים שאינם orthotopic, ללא לחיצה על האונה הערמונית מוזרק. בזהירות להחזיר את שלפוחית הזרע ואת האונה הערמונית מוזרק לתוך. חלל הבטן מבלי לוחצת על האונה. החלף את כל הרקמות המוחצנת. ביצוע תפרים רציפים כדי לסגור את מערכת השרירים בבטן הפנימי בתפרים מחט תפר נספג שנספג גזירה לאחור 5-0. ביצוע תפרים קטעה לסגור בעור בטן החיצוני עם 4-0 ניילון monofilament גזירה לאחור נספגים המחט התפרים.הערה: סיכות סטיריליים 9 מ מ יכול לשמש גם כדי לסגור את העור בבטן החיצוני. עם זאת, בניגוד התפרים, הם להפריע גידול זוהרים, פלורסנט עוקבות הדמיה אות. לנקות את כל הכלים עם מגבונים סטריליים אתנול (נפתח על-ידי המסייע המנתח) ומניחים מעקר חרוז זכוכית עבור אפשר ס’ 30 הכלים לייבוש לפני השימוש על העכבר הבאה. לרוקן את המזרק ואת המחט בתוך תמיסת מלח סטרילית (נפתח על-ידי המסייע המנתח) כדי למנוע סתימת מאת שריד matrigel.הערה: עוזרת המנתח צריך להיות נוכח עבור כל פעולות, ביצוע כל שאינו סטרילי העכבר שטרם-נותחו הכנה וגם העכבר לאחר הניתוח טיפול, כמו גם לערבב את הפתרון matrigel Myc-קאפ לפני זריקות. כדי לצמצם את זמן, כמו כל הליך אינטרה-הערמונית עכבר ידרוש 20-30 דקות, המסייע המנתח יכול להתחיל בהכנת העכבר הבאה כפי המנתח הוא תפירת העכבר הנוכחי. 4. לאחר הניתוח העכבר טיפול לנהל 1 מ”ג/ק”ג של meloxicam מאלחש ספורטינג באופן מיידי, 24 שעות ביממה ו- 48 שעות לאחר הניתוח. לאפשר עכברים לשחזר בכלוב ללא מצע באמצע הדרך מונחת כרית החימום. לפקח על עכברים במשך לפחות 30 דקות לאחר הניתוח עד שהם ישובו נורמלי ניידות ופעילות, אחרי אשר מקם אותם בתוך כלוב נקי עם אוכל על הרצפה של הכלוב. עוד לפקח על עכברים מדי יום עבור ריפוי הפצע תקין משקל גוף, טיפוח, ambulation לאחר הניתוח. עכברים נפרד לתוך כלובים נפרדים על ראיות של לחימה. הסר כל התפרים שנותרו בתוך 14 ימים לאחר הניתוח. 5. ביולומנאסן הגידול הדמיה להכין סטרילי-מסוננים Na+ או K+ D-luciferin, כפי שתואר על ידי היצרן ומוגן בפני אור. מזריקים עכברים intra-peritoneally 10 µL גרם של משקל הגוף של luciferin. לפחות 10 דקות מאוחר יותר, התמונה עכברים עם IVIS ספקטרום הדמיה מערכת, תיאר כאמור34,35. ניתוח תמונות בעזרת תוכנה תמונה חיה, כפי שתואר לעיל34,35.הערה: IVIS הדמיה ניתוח שימושי לקביעת זריקות אינטרה-הערמונית מוצלחת והתפתחות הגידול הראשוני לנרמל את נטל הגידול בקרב קבוצות הניסוי. עם זאת, תלוי בעוצמת האות זוהרים או פלורסנט, רוויה עלולה לגרום מישור כימות התמונה למרות גידול בגודל הגידול בפועל. לכן, בשלבים המאוחרים יותר של הגידול, הדמיה IVIS עשויים להיות שימושיים לקבוע ירידה בגודל הגידול על טיפול מוצלח ולא העלאות גודל לאחר התמונה רוויה. 6. הגידול איסוף, ניתוח גידול, הישרדות קצה אם אוסף הגידול בניתוח, המתת חסד עכברים CO2 והחשיפה משני נקע בצוואר הרחם, או על ידי שיטות אלטרנטיביות IACUC אושרה, ומכבד לנתח גידולים מהבטן. גידולים צריך להיות ממוקם orthotopically ערמונית.הערה: גידולים לדופן הבטן הקדמי או נזרע לאורך כל הבטן מצביעים על הזרקת אינטרה-הערמונית עניים או דולפים, אין להתייחס גידולים orthotopic. שוקלים הגידולים. חישוב נפח הגידול כמו π/6 × L × W × H (L = אורך הציר הארוך של הגידול, W = רוחב בניצב, H = גובה אנכי). גידולים יכולים להיות מנותח על ידי היסטולוגיה (תיקון בפורמלין במאגר נייטרלי 10%), flow cytometry (ליצור תא בודד השעיות), חלבונים (הכנת הרקמה lysate במאגר ריפה), או RNA (מיד רקמות במקום ב- RNAlater). לניתוח חיסוניות, גם לאסוף את הערמונית מרוקנות-גידול פארא-ותיני בלוטות הלימפה (איור 1B, תפוזים) והן בטחול.הערה: אם בעקבות עכברים להישרדות, נקודת הקצה של מודל זה מוגדר כהופעת מיימת בבטן hemorrhagic36 ו/או ירידה ambulation, טיפוח, ו/או piloerection37. עכברים לצורך ניתוח הישרדות מקבלים שיכוך כאבים לפני ואחרי הניתוח (פרוטוקול שלבים 2.2, 4.1), חייב להיות במעקב קבוע. עכברים להפרידם לתוך כלובים נפרדים אם שאלחם מתהווה, והיא צריכה להרדימם בצורה אנושית על המראה של כל הקריאות הקצה לעיל. 7. ניתוח סירוס לדגם CRPC המודל CRPC, ביצוע האמור לעיל בפרוטוקול הזרקה של הערמונית-“אינטרה” (פרוטוקול שלבים 1-5). לפחות שבוע מאוחר יותר, לאחר התפתחות גידולים, לבצע סירוס כירורגי באמצעות החריצה, כפי שתואר לעיל38. רגרסיה הגידול צג, הישנות על ידי הדמיה זוהרים. לאחר סירוס, רגרסיה הגידול יתרחש בתוך 3 ימים, הישנות הגידול יתרחש בתוך 30 יום לערך, המייצג את CRPC.