Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager
Summary
Detta meddelande beskriver metoder för isolering och kultur av alveolära makrofager från människor och murina modeller i experimentsyfte.
Abstract
Alveolära makrofager är terminalt differentierade, lung-bosatta makrofager av prenatal ursprung. Alveolära makrofager är unika i sitt långa liv och deras viktiga roll i lungans utveckling och funktion, samt deras lung-lokaliserad svar på infektion och inflammation. Hittills finns ingen enhetlig metod för identifiering, isolering och hantering av alveolära makrofager från människor och möss. Sådan metod behövs för studier på dessa viktiga innate immuna celler i olika experimentella inställningar. Den metod som beskrivs här, som lätt kan antas av alla laboratorier, är en förenklad metod att skörda alveolära makrofager från bronkoalveolär lavage vätska eller lungvävnad och underhålla dem in vitro. Eftersom alveolära makrofager uppstå primärt som vidhäftande celler i alveolerna, fokuserar denna metod på lossnar dem före skörd och identifiering. Lungan är en högt vaskulariserad organ och olika celltyper med myeloiska och lymfoida ursprung bebor, interagera och påverkas av den lung mikromiljö. Genom att använda uppsättningen ytmarkörer som beskrivs här, kan forskare enkelt och entydigt skilja alveolära makrofager från andra leukocyter, och rena dem för nedströms tillämpningar. Metoden kultur framkallade häri stöder både mänskliga och mus alveolära makrofager för in vitro tillväxt, och är kompatibel med cellulära och molekylära studier.
Introduction
Den lung närmiljön är ett unikt komplexa ekosystem med en genomarbetad luft conduit och kärlsystemet. Inandningsluften färdas genom luftstrupen och många grenar bronker och bronkioler innan den når alveolerna, där blod-air gasutbyte sker. På grund av direkt interaktion med atmosfären kräver respiratoriska ytan skydd från de potentiellt skadliga effekterna av luftburna partiklar och föroreningar. Ett antal fysiska, kemiska och immunologiska barriärer skydda lungorna. Särskilt, serverar distribution av fagocyter vid respiratoriska ytan en viktig första linjens försvarssystem. Alveolära makrofager (AMs) är en typ av lungcancer är boförälder fagocyter, och de utgör majoriteten av lung makrofag poolen. Som namnet antyder, AMs är främst lokaliserade till alveolära lumen och förekomma som fastsittande celler som ständigt prova den omgivande atmosfären och kommunicera med den alveolära epitel1. I steady-state lungorna är mer än 95% av fagocyter i alveolära utrymmet AMs2, vars sammansättning kan förändra på grund av inflammation, infektion eller kronisk exponering för föroreningar.
AMs delta i ett brett utbud av funktioner som kan vara lokalt för lungorna och/eller systemvikt. Till exempel är AMs väsentliga för utvecklingen och en optimalt fungerande lungor; immun övervakning. och clearance av cellulära skräp, invaderande patogener och inhalerade partiklar3,4,5,6,7. Riktade utarmning av AMs är känt för att försämra clearance av respiratoriska virus och bakterier4,8. Förutom sin roll som fagocyter och en första linjens försvarare av pulmonell homeostas, AMs är kända att fungera som antigen-presenterande celler i framkalla T cell immunitet9, potentierande effekten av intranasalt vaccin10 och påverka lung-begränsad autoimmunitet efter lung transplantation11,12. Brist i AM funktion har kopplats till pulmonell alveolär proteinosis (PAP), ett tillstånd som följd av en genetisk mutation, malignitet eller infektion som försämrar clearance av pulmonell tensider13,14. Transplantation av AMs är nu utforskas som en terapeutisk metod för behandling av PAP 15,16.
AMs är kända för sitt ursprung under embryogenes och kvarstå i lungorna under hela livet utan att ersättas av cirkulerande leukocyter2,17. Även AM omsättning är omätbara i homeostatiska lungor, har varierande nivåer av AM omsättning rapporterats i vissa kliniska tillstånd inklusive infektion av influensa virus4, myeloablativ bestrålning18, exponering för endotoxin 19och ålderdom20. AMs tros själv förnya via en låggradig spridning17,21, men några nyligen gjorda studier hävdar att monocyter kan ge upphov till en befolkning av intravaskulär lung makrofager22,23 under experimentella förhållanden, men funktionaliteten i dessa nyligen konverterade pulmonell makrofager har ännu inte definieras i lungsjukdomar. Dessutom förstå tröskeln till stimulans i samband med AM aktivering är ett potentiellt intressant område, som lungorna försöker bevara en equilibrium mellan de inflammatoriska signalerna och immunoregulatoriska maskiner.
De fysiologiska eller patologiska förändringar som leder till förlust av immunreglering är viktigt att utvärdera i olika kliniska inställningar (t.ex. luftvägsinfektioner, inflammatorisk lungsjukdom och fibrotiska lungsjukdom). AMs redovisas dock alltmer som indikatorer eller ens bestämningsfaktorerna för pulmonell hälsa11,24. För närvarande finns det inga enhetliga protokoll som är tillgängliga för skörd, karakterisera eller upprätthålla AMs från människor och prekliniska murina modeller. Bristen på samförstånd om AM prekursorer och fenotyper och avsaknad av en detaljerad metod hade varit den stora vägspärren i dechiffrera roller för AM i pulmonell hälsa och sjukdom. Följande protokoll erbjuder en slutgiltig identifiering, isolering och in vitro- kultur strategi som kraftigt kommer att främja förståelsen av AM beteende och underlätta AM-riktade diagnostiska och terapeutiska studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs är långlivade lung-bosatta makrofager som befolkar lungorna börjar vid födseln och bestående över den hela livslängd26. Deras roller i pulmonell fysiologi7 och patologi12 och deras potential att förutsäga pulmonell autoimmunitet24 har erkänts. Eftersom AMs har en långsiktig närvaro i lungorna11,27 och eftersom de är inblandade i aktiveringen och progre…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Clare Prendergast för hjälp med redigering manuskriptet. DKN stöds av en forskning ger (nr 2095) från stiftelsen Flinn och TM stöds genom bidrag från National Institutes of Health (R01HL056643 och R01HL092514). DKN utvecklat metoder, designat studien och skrev manuskriptet; OM bistod med djurstudier och kliniska prov upphandling. SB bistod med flöde flödescytometrisk analys och cell sortering; TM övervakade studierna och granskade manuskriptet.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
Referencias
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
