Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen
Summary
Deze mededeling beschrijft methodologieën voor isolatie en cultuur van de alveolaire macrofagen van mens en lymfkliertest modellen voor experimentele doeleinden.
Abstract
Alveolaire macrofagen zijn terminaal gedifferentieerde, Long-inwoner van macrofagen van prenatale oorsprong. Alveolaire macrofagen zijn uniek in hun lange levensduur en hun belangrijke rol in de ontwikkeling van de Long en functie, evenals hun Long-gelokaliseerde reacties op infecties en ontstekingen. Tot op heden bestaat er geen uniforme methode voor de identificatie, isolatie, en behandeling van de alveolaire macrofagen van mensen en muizen. Deze methode is nodig voor studies over deze belangrijke aangeboren immuun cellen in verschillende experimentele instellingen. De methode die hier beschreven, die kan gemakkelijk door elk laboratorium worden aangenomen, is een vereenvoudigde aanpak voor het oogsten van de alveolaire macrofagen uit bronchoalveolar lavage vloeistof of longweefsel en onderhouden hen in vitro. Omdat alveolaire macrofagen voornamelijk als Adherente cellen in de longblaasjes optreden, is de focus van deze methode op hen verjagend voorafgaand aan de oogst en identificatie. De Long is een zeer gevacuoliseerd orgaan, en verschillende celtypes van myeloïde of lymfoïde oorsprong bewonen, interactie en worden beïnvloed door de communicatie van de longen. Met behulp van de set van oppervlakte markers beschreven hier, kunnen onderzoekers gemakkelijk ondubbelzinnig alveolaire macrofagen onderscheiden van andere leukocyten en zuiveren ze voor downstream toepassingen. De methode van de cultuur ontwikkeld hierin ondersteunt beide mens muis alveolaire macrofagen in vitro groeimogelijkheden en is compatibel met cellulaire en moleculaire studies.
Introduction
De Long-communicatie is een uniek complex ecosysteem met een uitgebreide lucht conduit en therapieën. De ingeademde lucht reist via de luchtpijp en vele vertakkingen van de bronchiën en bronchioli alvorens de longblaasjes, waar het bloed-lucht gasuitwisseling plaatsvindt. Als gevolg van directe interactie met de atmosfeer vereist het respiratoire oppervlak bescherming tegen de potentieel schadelijke effecten van deeltjes in de lucht en verontreinigende stoffen. Een aantal fysieke, chemische en immunologische belemmeringen beschermen de longen. Implementatie van fagocyten aan de luchtwegen oppervlakte dient met name een belangrijke eerste regel verdedigingssysteem. Alveolaire macrofagen (AMs) zijn een soort Long-ingezeten fagocyten, en ze vormen de overgrote meerderheid van de longkanker macrofaag zwembad. Zoals hun naam al doet vermoeden, AMs zijn voornamelijk gelokaliseerd op de alveolaire lumen en optreden als sessiele cellen die voortdurend de omgevingsklimaat proeven en communiceren met de alveolaire epitheel1. In stationaire toestand longen zijn meer dan 95% van de fagocyten in de alveolaire ruimte AMs2, waarvan de samenstelling als gevolg van ontsteking, infectie of chronische blootstelling aan verontreinigende stoffen wijzigen kan.
AMs deelnemen aan een breed scala van functies die mogelijk lokale naar de longen en/of systemische belang. Bijvoorbeeld, zijn AMs van essentieel belang in de ontwikkeling en de optimale werking van de longen; immuun toezicht; en de ontmijning van cellulaire puin, invasie van ziekteverwekkers, en geïnhaleerde deeltjes3,4,5,6,7. Gerichte uitputting van AMs heet schade kunnen toebrengen aan de goedkeuring van de respiratoire virussen en bacteriën4,8. Naast hun rol als fagocyten en een verdedigers van de eerste regel van de pulmonaire homeostase, AMs zijn gekend om te functioneren als antigeen-presenteren cellen in het opwekken van T cel immuniteit9, potentiating van de werkzaamheid van intranasale vaccin10 en Long-beperkte autoimmuniteit na Long transplantatie11,12te beïnvloeden. Tekort aan AM functie is gekoppeld aan de pulmonaire alveolaire proteinosis (PAP), een aandoening als gevolg van een genetische mutatie, maligniteit of infectie die Goedkeuringvande pulmonaire oppervlakteactieve stoffen13,14 schaadt. Transplantatie van AMs is nu onderzocht als een therapeutische benadering voor de behandeling van PAP 15,16.
AMs zijn bekend ontstaan tijdens de embryogenese en te volharden in de longen gedurende het hele leven zonder verdrongen door het circuleren van leukocyten2,17. Hoewel, AM omzet is niet detecteerbaar in homeostatische longen, zijn verschillende niveaus van AM omzet gemeld in bepaalde klinische voorwaarden met inbegrip van infectie door het influenza virus4, myeloablative bestraling18, blootstelling aan endotoxinen 19es20van de ouderdom. AMs worden verondersteld zelf vernieuwen via een low-grade proliferatie17,21, maar sommige recente studies beweren dat monocyten aanleiding kunnen geven tot een bevolking intravasculaire Long macrofagen22,23 onder experimentele omstandigheden, maar de functionaliteit van deze nieuwe geconverteerde pulmonaire macrofagen moeten nog worden omschreven in longziekten. Bovendien begrijpen de drempel van stimulus in het kader van de activering van de AM is een potentieel interessant gebied, zoals de Long probeert te behouden een evenwicht tussen de inflammatoire signalen en de immunoregulerende machines.
De fysiologische of pathologische veranderingen die tot verlies van immuunregulatie leiden zijn belangrijk om te evalueren in verschillende klinische settings (bijvoorbeeld infecties van de luchtwegen, inflammatoire longziekte en fibrotische longziekte). AMs zijn echter steeds meer erkend als indicatoren of zelfs determinanten van de gezondheid van de pulmonaire11,24. Momenteel zijn er geen uniforme protocollen beschikbaar voor oogsten, karakteriseren, en/of onderhouden AMs van mens en preklinische lymfkliertest modellen. Ontbreken van een consensus op AM precursoren en fenotypes en het ontbreken van een gedetailleerde methodologie hadden de grote wegversperring in ontcijferen rol(len) van AM bij pulmonaire gezondheid en ziekte. Het volgende protocol biedt een definitieve identificatie, isolatie en in vitro cultuur strategie die sterk zal verder van het begrijpen van AM gedrag en AM-gerichte diagnostische en therapeutische studies te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs zijn lang-leven Long-ingezeten macrofagen die bevolken de longen beginnen bij de geboorte en blijvende over de gehele levensduur26. Hun rol in de pulmonaire fysiologie7 en pathologie12 en hun potentieel voor het voorspellen van pulmonaire autoimmuniteit24 zijn bekroond. Omdat AMs een langdurige aanwezigheid in longen11,27 hebben en omdat zij betrokken bij de active…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Clare Prendergast voor hulp bij het bewerken van het manuscript. DKN wordt ondersteund door een onderzoek verlenen (#2095) van de Stichting Flinn en TM wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01HL056643 en R01HL092514). DKN de methodes ontwikkeld, ontworpen voor de studie en schreef het manuscript; OM bijgestaan met dierstudies en klinische monster aanbestedingen; SB bijgestaan met Flow cytometrische analyse en cel sorteren; TM onder toezicht van de studies en het herzien van het manuscript.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
Referencias
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
