Summary

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Published: April 20, 2018
doi:

Summary

Это сообщение описывает методологий для изоляции и культуре альвеолярных макрофагов от людей и мышиных моделях для экспериментальных целей.

Abstract

Альвеолярные макрофаги являются безнадежно дифференцированной, легких резидентов макрофаги дородовой происхождения. Альвеолярные макрофаги являются уникальными в их долгой жизни и их важную роль в разработке легких и функции, а также их локализованные легких ответов на инфекции и воспаления. На сегодняшний день, существует не единый метод для идентификации, изоляции и обработки альвеолярных макрофагов от людей и мышей. Такой метод необходим для исследования на эти важные врожденные иммунные клетки в различных экспериментальных условиях. Метод, описанный здесь, который может быть легко принят любой лаборатории, это упрощенный подход для уборки альвеолярных макрофагов с Бронхоальвеолярный лаваж жидкости или из легочной ткани и поддержание их в пробирке. Потому что альвеолярные макрофаги главным образом происходят как адэрентных клеток в альвеолы, этот метод посвящен выбить их до сбора урожая и идентификации. Легких является весьма васкуляризированной органом, и различные типы клеток миелоидного и лимфоидных происхождения населяют, взаимодействуют и находятся под влиянием легкого микроокружения. С помощью набора поверхностных маркеров, в описанный здесь, исследователи могут легко и однозначно отличить от других лейкоцитов альвеолярных макрофагов и очищают их вниз по течению приложений. Здесь разработанный метод культуры поддерживает оба человека и мыши альвеолярных макрофагов в пробирки роста и совместим с клеточной и молекулярной исследований.

Introduction

Микроокружения легких является уникально сложной экосистемы с каналом разработки воздуха и сосудистую. Вдыхаемый воздух проходит через трахею и многочисленные филиалы бронхов и бронхиол до достижения альвеолы, где происходит обмен газа крови воздух. Из-за прямое взаимодействие с атмосферой дыхательную поверхность требует защиты от потенциально вредного воздействия частиц и загрязнителей. Количество физических, химических и иммунологических барьеров защитить легкй. В частности развертывания фагоцитов на дыхательную поверхность обслуживает систему важной первой линии обороны. Альвеолярных макрофагов (AMs) являются одним из видов легких резидентов фагоцитов, и они составляют подавляющее большинство легких макрофагов бассейн. Как их названия, AMs преимущественно локализуются в просвете альвеол и происходят как сидячие клетки, которые постоянно образца окружающей атмосферы и общаться с альвеолярный эпителий1. В стационарном состоянии легких более 95% фагоцитов в альвеолярной пространстве являются AMs2, состав которых может измениться из-за воспаления, инфекции или хронического воздействия загрязнителей.

АПП участвовать в широком диапазоне функций, которые могут быть локальными для легких и/или имеющим системное значение. Например AMs имеют важное значение в развитии и оптимального функционирования легких; иммунной наблюдения; Распродажа сотовой мусора, вторгаясь патогенов, и вдыхании частиц3,4,5,6,7. Целевые истощение AMs известно повредить Распродажа респираторных вирусов и бактерий в4,8. Помимо их роли как фагоцитов и первой линии защитников легочной гомеостаза, AMs известны функционировать как антиген представляющих клеток в вызывая T клетки иммунитета9, потенцирования эффективность интраназальная вакцина10 и влияние на легких ограничено аутоиммунные заболевания после трансплантации легких11,12. Дефицит в AM функции были связаны с легочных альвеол proteinosis (PAP), состояние в результате генетической мутации, злокачественности или инфекции, что ухудшает Распродажа легочной ПАВ13,14. Трансплантация AMs сейчас изучается как терапевтический подход для лечения Пап 15,16.

АПП, как известно, происходят во время эмбриогенеза и сохраняются в легких на протяжении всей жизни без будучи заменена циркулирующих лейкоцитов2,17. Хотя, AM оборот не обнаруживается в гомеостатических легких, различные уровни оборота утра были зарегистрированы в некоторых клинических условиях, включая инфекции гриппа вирус4, myeloablative облучения18, подверженности эндотоксинов 19и20старости. АПП верил самостоятельного возобновить через низкосортных распространения17,21, но некоторые недавние исследования утверждают, что моноциты может породить населением внутрисосудистого легких макрофаги22,23 под экспериментальных условиях, но функциональность этих новообращенных легочной макрофагов еще должен быть определен в легочных заболеваний. Кроме того понимание порог стимул в контексте AM активации является потенциально интересный район, как легких пытается сохранить равновесие между воспалительных сигналов и иммунорегуляторное машины.

Физиологические и патологические изменения, которые приводят к потере иммунной регуляции имеют важное значение для оценки в различных клинических параметров (например, респираторные инфекции, заболевания легких, воспалительных и фиброзных легочных заболеваний). Тем не менее AMs все чаще признаются в качестве показателей или даже детерминанты здоровья легких11,24. В настоящее время есть нет единых протоколов для сбора урожая, характеризующие, и/или поддержание AMs от людей и доклинические мышиных моделях. Отсутствие консенсуса по утра прекурсоров и фенотипы, а подробная методология была основным камнем преткновения в расшифровке роль(и) AM в легких здоровья и болезни. Следующий протокол предлагает окончательное определение, изоляции и в пробирке культуры стратегию, которая будет значительно глубокого понимания поведения AM и облегчить AM-целенаправленных диагностических и терапевтических исследований.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и институционального обзора Совет (IRB) в госпиталь и медицинский центр Святого Иосифа. 1. изоляция AMs из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) жидкости Обезболивают…

Representative Results

Поток гранулярных подход к идентификации мыши АПП показано на рисунке 1. Это включает в себя анализ минимальный набор необходимых в разграничении AMs от других легких резидентом или легкого проникновения фагоцитов поверхностных маркеров. Дифференциал?…

Discussion

АПП являются долгоживущие легких резидентов макрофаги, заполняющих легких, начиная с рождения и Несокрушимая над всей жизни26. Их роль в физиологии легких7 и патологии12 и их потенциал для прогнозирования легочной аутоиммунитета24 были…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Клэр Прендергаст за помощь с редактирования рукопись. DKN поддерживается путем исследования Грант (#2095) Фонда Флинн и ТМ поддерживается за счет субсидий из Национального института здравоохранения (R01HL056643 и R01HL092514). DKN разработали методы, Дизайн исследования и написал рукопись; ОМ, помогал с исследования на животных и клинические образцы закупок; SB, помогал с потоком гранулярных анализа и сортировки клеток; TM руководил исследования и обзор рукопись.

Materials

Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

Referencias

  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  3. Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
  4. Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
  5. MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
  6. Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
  7. Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
  8. Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
  9. Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
  10. Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
  11. Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
  12. Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
  13. Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
  14. Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
  15. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
  16. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  17. Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
  18. Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
  19. Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
  20. Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  21. Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
  22. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
  23. Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
  24. Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
  25. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
  26. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  27. Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
  28. Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).

Play Video

Citar este artículo
Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

View Video