Summary

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Published: February 28, 2018
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Summary

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Abstract

Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des Magen-Darm-Trakt durch die Generierung von toleranten Responses to diätetische Antigene und Kommensalen Bakterien bei der Montage effektiv Immunantworten auf enteropathogenic Mikroben. Darüber hinaus ist es deutlich geworden, dass lokale Darm Immunität eine profunde Auswirkung auf fernen und systemische Immunität hat. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie eine intestinale Immunantwort induziert wird und was das immunologische Ergebnis der Reaktion ist. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Dünndarm induktive Seiten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und die mesenterialen Lymphknoten und Effektor Websites wie die Lamina Propria beschrieben und die Darmepithel. Diese Technik sorgt für Isolierung von einer großen Anzahl von Lymphozyten aus kleinen intestinalen Gewebe mit optimaler Reinheit und Lebensfähigkeit und minimale wohnzimmertaugliche Kontamination innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen. Die technische Möglichkeiten zum Isolieren von Lymphozyten und anderen Immunzellen aus den intestinalen Geweben ermöglicht das Verständnis der immunen Antworten zu Magen-Darm-Infektionen, Krebs und entzündliche Erkrankungen.

Introduction

Gastrointestinaltrakt (GI) hat viele Falten und Vorsprünge, die die größte Oberfläche trennt das Innere des Körpers und der äußeren Umgebung darstellt. Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des GI-Trakt. Es ist ständig diätetische Antigene, Kommensalen Bakterien und pathogenen Mikroben ausgesetzt. Als solche muss tolerant gegen Nahrungsmittel-Antigene und Kommensalen Bakterien bleiben und gleichzeitig die Fähigkeit, schnell eine effektive Immunantwort gegen enteropathogenic Mikroben1erzeugen. Des intestinalen Immunsystems können anatomisch unterteilt werden induktive Sites, wo naive Lymphozyten durch antigenpräsentierende Zellen Antigene von der Darmschleimhaut tragen aktiviert werden, und Effektor Sites, wo aktivierte Lymphozyten bestimmte ausüben Effektor-Funktionen2. Die induktive Websites umfassen die organisierte lymphatischen Struktur von Peyer Patches (PP), die im Darmlumen direkt durch das Wirken des spezialisierten M-Zellen und die regionalen mesenterialen Lymphknoten (MLN) Umfragen. Die Effektor-Seiten bestehen aus der Lamina Propria (LP), die das Bindegewebe unterhalb der Basalmembran und das Darmepithel, eine einzelne Zelle Schicht oberhalb der Basalmembran, die intraepitheliale Lymphozyten (IEL) enthält. Lymphozyten sind wichtige Akteure der adaptiven Immunität, die Schutz gegen Infektionen und Krebs zu vermitteln und auch zu Immunpathologie bei entzündlichen Erkrankungen beitragen können. Es ist wichtig und hochaktuellen Lymphozyten in diesen unterschiedlichen studieren anatomische Schleimhaut Fächer besser verstehen ihre Induktion und Effektor-Funktionen.

Eine relativ einfache und einheitliche Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus diesen Fächern ist erforderlich, da die Anzahl der Ermittler erkunden immun Ereignisse im Darm beschleunigt werden. Mehrere Forschergruppen haben Protokolle veröffentlicht, die mehrere ähnliche Prozesse für die Isolierung von Immunzellen aus dem Maus kleine Darm Fächer3,4,5,6,7 Teilen . Allerdings gibt es mehrere technische Unterschiede zwischen ihnen je nach Schwerpunkt des einzelnen Protokolls. Zum Beispiel mit dem Fokus auf Immunzellen aus der LP zu isolieren, untersucht ein Protokoll die Auswirkungen der verschiedenen enzymatischen Verdauung im Zellviabilität, Zelle Oberfläche Marker Ausdruck und die Zusammensetzung der isolierten Immunzellen5. Ein anderes Protokoll zeigt eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Isolierung von Lymphozyten ohne Dichte Zentrifugation6. Schließlich gibt es spezifische Protokolle auch zur Isolierung von mononukleären Phagozyten aus verschiedenen Gewebeschichten des Dünndarms7. Hier ist ein hoch reproduzierbare Protokoll, sequentielle Isolation der Lymphozyten-Populationen aus dem MLN, PP, LP und IEL Fach des Dünndarms ermöglicht, präsentiert.

Wir konzentrieren uns auf hochgereinigte Populationen aus der LP und IEL Fächer, die weitgehend frei von Verunreinigungen aus anderen Darm Fächer sind zu isolieren. Dies verbreitete Protokoll erzeugt eine hohe Ausbeute an maximal rein und lebensfähige Lymphozyten innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen4,8,9,10,11,12. Dieses Protokoll sorgt dafür auch die Isolation der Lymphozyten aus dem LP und IEL Fach mit minimalen wohnzimmertaugliche Kreuzkontamination, eine bona fide Möglichkeit zum Lymphozyten in diese unterschiedliche Fächer studieren. Die isolierten Lymphozyten können weitere Manipulationen wie durchflusszytometrischen Analyse oder funktionelle Analyse unterzogen werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf die Isolation der Lymphozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm bei bakteriellen Infektionen wie Listeria Monocytogenes, Salmonella Typhimuriumund Yersinia Pseudotuberculosis angewendet Infektionen und entzündlichen Erkrankungen wie z. B. chemische und Pathogen-induzierten Kolitis. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um angeborene immune Zellen wie dendritische Zellen, Makrophagen, Neutrophilen und Monozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm zu isolieren.

Protocol

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien des National Institute of Health und durch die Stony Brook University institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Genehmigungen erteilt werden, vor der Durchführung der Verfahren. 1. Vorbereitung der Lösung HGPG (HEPES, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und Gentamycin), 100 × Mischen Sie 59,6 g H…

Representative Results

Eine schematische Darstellung des Protokolls dargestellt (Abbildung 1). Lymphozyten in der Darmschleimhaut induktive und Effektor Websites sind deutlich organisiert. Peyer ist Patches (PP) und mesenterialen Lymphknoten (MLN) enthalten Lymphozyten in gut organisierten Bereichen der T-Zellen und B-Zell-Follikel, während das Darmepithel Lymphozyten enthält, die mehr diffus verteilt werden. Die Lamina Propria (LP) enthält sowohl diffus verteilte Lymphozyten un…

Discussion

Ein detailliertes Protokoll wird für die Isolierung von Lymphozyten aus der intestinalen Schleimhaut präsentiert, induktive (MLN und PP) und Effektor (LP und IEL Fach) Seiten. Das Protokoll wurde entwickelt, um (Uhrzeit) und Ausgang (Lebensfähigkeit und Ertrag) zur Maximierung der Produktivität und Ergebnisse zu balancieren. Das Protokoll gewährleistet auch minimal wohnzimmertaugliche Kreuzkontaminationen zwischen LP und IEL Fächer.

Mehrere Protokolle für die Isolierung von Immunzellen …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

B.S.S. wird von NIH Grant (R01 AI076457) und von der Stony Brook University zur Verfügung gestellten Mittel unterstützt. Z.Q stützt sich auf NIH (K12 GM102778) zu gewähren.

Materials

HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

Referencias

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Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

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