Summary

Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Published: July 04, 2018
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células de mástil peritoneales murinas. También describimos dos protocolos para su caracterización funcional: una proyección de imagen fluorescente de la concentración de Ca libre2 + intracelular y una prueba de degranulación basado en la cuantificación colorimétrica de la β-hexosaminidasa lanzado.

Abstract

Mastocitos (MCs), como parte del sistema inmunológico, juegan un papel clave en la defensa del huésped contra varios patógenos y en la iniciación de la respuesta inmune alérgica. La activación de MCs por el cross-linking de superficie IgE limitado a receptor de IgE de alta afinidad (FcεRI), así como a través de la estimulación de varios otros receptores, inicia el ascenso del libre intracelular Ca2 + nivel ([Ca2 +]) que promueve la liberación de mediadores inflamatorios y alérgicos. La identificación de los componentes moleculares implicados en estas vías de señalización es fundamental para la comprensión de la regulación de la función de MC. En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento de murine del tejido conectivo tipo MCs por lavado peritoneal y la cultivación de MCs peritoneales (CMP). Culturas de MCs de diferentes modelos de ratón knockout por esta metodología representan un método útil para la identificación de proteínas implicadas en rutas de señalización de MC. Además, también se describe un protocolo para la célula Fura-2 proyección de imagen como una importante técnica para la cuantificación de Ca2 + en MCs. basada en fluorescencia monitoreo de [Ca2 +] es un confiable y enfoque de uso general estudio de Ca2 + señalización de eventos, incluyendo la entrada de calcio con tienda que funciona, que es de suma importancia para la activación de MC. Para el análisis de MC degranulación, se describe un ensayo de liberación de β-hexosaminidasa. La cantidad de β-hexosaminidasa liberado en el medio de cultivo se considera como un marcador de degranulación para diferentes subconjuntos secretores de todos tres descrito en MCs. β-hexosaminidasa puede cuantificarse fácilmente por su reacción con un sustrato de colorigenic en un Análisis colorimétrico de la placa de microtitulación. Esta técnica altamente reproducible es rentable y no requiere ningún equipo especializado. En general, el protocolo siempre demuestra un alto rendimiento de MCs expresan marcadores de superficie típico MC, mostrando las características morfológicas y fenotípicas típicas de MCs y demostrando las respuestas altamente reproducibles a secretagogos en Ca2 +– Análisis de la proyección de imagen y degranulación.

Introduction

MCs juega un papel destacado durante las respuestas inmunitarias innatas y adquiridas. Específicamente, MCs participa en la muerte de patógenos, como bacterias y parásitos y también degradan péptidos endógenos potencialmente tóxicos o componentes de venenos (para revisión ver Galli et al. 20081). El papel fisiológico de MCs en la inmunidad innata y adaptativa es objeto de acalorado debate. Por lo tanto, las numerosas discrepancias de datos en los estudios realizados con diferentes modelos de ratón deficientes en MC requieren una reevaluación sistemática de las funciones inmunológicas de MCs más allá de alergia2. MCs madurados se localizan principalmente en tejidos y órganos como la piel, el pulmón y el intestino y generalmente sólo se encuentran en pequeña cantidad en la sangre. MCs derivan de precursores hematopoyéticos, como progenitores de MC y completar su diferenciación y maduración en los microambientes de casi todos los tejidos vascularizados1. Factor derivado de células T interleukin (IL) -3 selectivamente promueve la viabilidad, proliferación y diferenciación de una población de pluripotent del ratón MCs de sus progenitores hematopoyéticos3. Factor de células madre (SCF) es producida por células estructurales en los tejidos y desempeña un papel crucial en la MC desarrollo, supervivencia, la migración y función4. Las propiedades de los MCs pueden diferir dependiendo de su capacidad para sintetizar y almacenar diversas proteasas o proteoglicanos. En ratones, se distinguen el tipo de tejido conectivo denominada MCs de MCs mucosa según su localización anatómica, morfología y contenido de heparina y proteasas5.

En MCs, un aumento del libre citosólico Ca2 + ([Ca2 +]) es indispensable para la degranulación y producción de eicosanoides, así como para la síntesis de citoquinas y activación de factores de transcripción en respuesta a antígenos y varios secretagogos6. Un objetivo importante aguas abajo de estos estímulos es la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato inositol 1,4,5-trifosfato y diacilglicerol (DAG). DAG activa la proteína quinasa C y IP3 libera iones de Ca2 + desde el retículo endoplásmico. Agotamiento de estas tiendas activa Ca2 + afluencia vía membrana plasmática Ca2 + , llevando a almacenar calcio operados entrada (SOCE). Este proceso es evocado a través de la interacción del Ca2 +-sensor, interacción stromal molecule-1 (Stim1), en el retículo endoplásmico con Orai17 , así como a través de la activación del canal de (TRPC) canónico potencial transitorio del receptor proteínas (para revisión ver Freichel et al. 20148) en la membrana plasmática.

Para estudiar el papel fisiológico de estos canales, varios farmacológico (uso de bloqueadores de los canales) o enfoques genéticos se utilizan típicamente. En este último caso, supresión de la expresión de la proteína se obtiene dirigiéndose a mRNA (caída) o ADN genómico con global o tejidos específicos9 canceladura de un exón codificación un poro formando la subunidad de un canal (eliminatorias). La disponibilidad de un bloqueador con suficiente especificidad para estos canales es limitada. Además, el enfoque de precipitación requiere un control cuidadoso de su efectividad mediante, por ejemplo., Western blot análisis y se ve obstaculizada por la falta de disponibilidad de anticuerpos específicos para la proteína de canal específicos en muchos casos. Así, el uso de modelos de ratón knockout todavía se considera como el estándar de oro para dicho análisis. Un modelo preferido en vitro para la investigación de las funciones de la MC es cultivo de CMP que pueden ser aisladas ex vivo como una población totalmente madura (a diferencia de la distinción de MCs en vitro de, por ejemplo., células de médula ósea)10 . En comparación con la médula ósea derivada de MCs (BMMCs), que también se utilizan para estudiar la función de MC en vitro, la estimulación de FcεRI y beta-hexosaminidase liberación aumenta 8 y 100-fold en CMP, respectivamente. En este artículo, describimos un método de aislamiento y cultivo de CMP murinas, que permite para obtener después de 2 semanas de cultivo de un elevado número de puro tejido conectivo tipo MCs, suficientes para su posterior análisis.

A pesar de recientes avances en el desarrollo y aplicación de indicadores genético codificados calcio, su uso es aún limitado por dificultades en la entrega de genes a las células diana, específicamente, en células altamente especializadas tales como MCs cultivadas primarios. Además, este grupo de indicadores fluorescentes de [Ca2 +] las mediciones aún carece de tintes radiométrica con un alto rango dinámico. Por estas razones, el método preferido para la medición radiométrica [Ca2 +] sigue siendo el uso del tinte fluorescente “Fura-2”11.

Actualmente, el más de uso general enfoque para la evaluación de MC activación y degranulación es la medida de actividad de β-hexosaminidasa. Β-hexosaminidasa, un mediador alérgico, es uno de los componentes de gránulo de MC que es lanzado conjuntamente con histamina en proporción constante de MCs12. Β-hexosaminidasa se puede medir fácilmente y con precisión a través de su reacción con un sustrato específico, que produce una cantidad mensurable de un producto colorigenic que es fácilmente detectable en un ensayo colorimétrico de microplacas. En este artículo, se divulga una aplicación de esta técnica para el análisis de las CMP degranulación en respuesta a una variedad de estímulos.

Agregación del receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidad (FcɛRI) activa en MCs una vía de señalización intracelular versátil, conduce a una liberación del contenido de gránulos secretores en el espacio extracelular circundante. Además el antígeno específico, muchos otros estímulos pueden activar MCs para liberar una gran variedad de mediadores inmunomoduladores, como complemento anaphylatoxins (e.g., C3a y C5a)13, el péptido vasoconstrictor la endotelina 1 (ET1)14 , así como numerosas sustancias catiónicas y drogas provocando reacciones pseudoallergic (e.g., icatibant)15 atando a MRGPRX216. Vías de señalización intracelular implicados en la Desgranulación inducida por MRGPR MCs mal se caracterizan con respecto a la señalización intracelular mediada por el FcɛRI; estas vías sólo comenzaron a ser estudiado intensamente durante los últimos pocos años17 después de la identificación del receptor del16. Los membrana plasmática canales del ion en la entrada de calcio seguido por estimulación MRGPRX2 siguen siendo en gran parte, para ser entendido. Por lo tanto, el presente artículo se centra también en la señalización intracelular del calcio y degranulación de los MCs estimulado con agonistas de la MRGPR.

Protocol

Animales todos los procedimientos fueron realizados según las directrices de la legislación alemana para el cuidado y uso de animales de laboratorio (oficialmente aprobado por el Consejo regional de Karlsruhe). 1. PMC aislamiento y cultivo de lavado Intraperitoneal 1 Hielo 2 jeringas de 10 mL 3 Agujas 27 G 4 Agujas de 20 …

Representative Results

PMCs se aislaron 3 ratones de tipo salvaje (C57BL/6N) por lavado intraperitoneal y más cultivadas en Medio RPMI suplementado con 20% de FCS y 1% Pen-Strep en presencia de factores de crecimiento (IL-3 a 10 ng/mL) y SCF a 30 ng/mL bajo estéril humedecido las condiciones en 37 ° C y 5% CO2. El medio fue cambiado durante los días 2 y 9 después el aislamiento de la célula. La morfología de la célula se analizó mediante la transmisión de luz de proyección de imagen de DIC…

Discussion

Modelos MC pueden utilizarse con éxito para el estudio de MC degranulación, quimiotaxis, adherencia, así como dilucidar vías intracelulares de transducción de señalización implicadas en la activación de MC. Algunos investigadores uso MCs los modelos humanos, como las líneas inmortalizadas (LAD2 y HMC1) o MCs humanas derivados de cordón de células progenitoras (CD133 +) y las células progenitoras de sangre periférica (CD34 +) de la sangre. Otros prefieren roedores modelos MC, como inmortalizados (leucemia bas…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean reconocer Julia Geminn para asistencia técnica en preparación de la célula de mástil y cultivo. Este trabajo fue apoyado por Fomento el centro de investigación colaborativa (TR-SFB) 152.

Materials

RPMI Medium Thermo Scientific 21875034
DPBS Sigma-Aldrich 14190144
FCS Thermo Scientific R92157
IL-3 R&D Systems 403-ML
SCF Thermo Scientific PMC2115
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2272
Fura-2 AM  Thermo Fischer Scientific F1221
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
DNP-HSA  Sigma-Aldrich A6661
Anti-DNP-Antibody  Sigma-Aldrich D-8406
Penstrep Thermo Scientific 15140122
Compound 48/80  Sigma-Aldrich C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol Sigma-Aldrich X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside Sigma-Aldrich N9376
CoverWell Imaging Chamber Sigma-Aldrich GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom  Corning 3896
96-Well plates, flat bottom Greiner Bio-One 655180
Microtiter plate reader with "i-control" software  Tecan Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate  Greiner Bio-One 655180
Ionomycin Sigma-Aldrich I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes Sarstedt 62.547.254 
Culture Flasks (25 cm) Greiner Bio-One 69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 Menzel CB00250RA1
Hemocytometer VWR 631-0696
Inverted Microscope Zeiss Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil Zeiss 440260-9900
HC Filter Set Fura 2  AHF H76-521
CCD Camera Zeiss AxioCam MRm 
Monochromatic Light Source Sutter Instruments Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program Zeiss AxioVision 4.8.2 
Gravity fed solution application system Custom Made 4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes Sarstedt 62,554,502
Bench Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R

Referencias

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Tsvilovskyy, V., Solis-Lopez, A., Öhlenschläger, K., Freichel, M. Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays. J. Vis. Exp. (137), e57222, doi:10.3791/57222 (2018).

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