Full-field optische coherentiemicroscopie voor histologie-achtige analyse van stromale kenmerken in hoornvliestransplantaten
Summary
We beschrijven het gebruik van full-field optische coherentiemicroscopie als een methode voor een hoogwaardige beoordeling van corneadonorstroma. Dit protocol kan worden gebruikt om kenmerken te identificeren die wijzen op gezondheid of ziekte, en is gericht op het verbeteren van de screening en selectie van donorweefsels, en dus de resultaten van keratoplastiek.
Abstract
De kwaliteit van het hoornvliesstroma van de donor, dat ongeveer 90% van de totale hoornvliesdikte uitmaakt, is waarschijnlijk een van de belangrijkste, zo niet de belangrijkste, beperkende factor (en) voor het succes van diepe voorste lamellaire en penetrerende keratoplastiek. Dit zijn chirurgische procedures waarbij een deel of alle zieke hoornvlieslagen worden vervangen door respectievelijk gedoneerd weefsel, het transplantaat, genomen van een onlangs overleden persoon. De middelen om de stromale kwaliteit van hoornvliestransplantaten in oogbanken te evalueren zijn echter beperkt en missen het vermogen van kwantitatieve beoordeling met hoge resolutie van ziekte-indicatoren. Full-field optische coherentiemicroscopie (FF-OCM), die 3D-beeldvorming met hoge resolutie van verse of vaste ex vivo biologische weefselmonsters mogelijk maakt, is een niet-invasieve techniek die zeer geschikt is voor de beoordeling van het donorhoornvlies. Hier beschrijven we een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van corneastroma met behulp van FF-OCM. Het protocol is met succes toegepast op normale donorhoornvliezen en pathologische hoornvliesknoppen en kan worden gebruikt om gezonde en pathologische kenmerken op zowel macroscopisch als microscopisch niveau te identificeren, waardoor de detectie van stromale stoornissen die de uitkomst van keratoplastiek in gevaar kunnen brengen, wordt vergemakkelijkt. Door de kwaliteitscontrole van het transplantaat te verbeteren, heeft dit protocol het potentieel om te resulteren in een betere selectie (en afstoting) van donorweefsels en dus minder transplantaatfalen.
Introduction
Hoornvliesaandoeningen behoren wereldwijd tot de belangrijkste oorzaken van blindheid1. Sommige ziekten kunnen alleen chirurgisch worden behandeld, vaak met de vervanging van een deel (d.w.z. lamellaire keratoplastiek) of het gehele (d.w.z. doordringende keratoplastiek) zieke hoornvlies, door gedoneerd weefsel, het transplantaat, genomen van een onlangs overleden persoon. Voor hoornvliesaandoeningen die het endotheel niet beïnvloeden (bijv. Keratoconus, stromale littekens na infectieuze keratitis, trauma en stromale dystrofieën), wordt diepe anterieure lamellaire keratoplastiek (DALK) momenteel beschouwd als de chirurgische techniek van keuze 2,3,4,5. Deze techniek maakt het behoud van het cornea-endotheel van de ontvanger mogelijk, door alleen het centrale cornea-epitheel en stroma te vervangen, wat geassocieerd is met een lagere incidentie van transplantaatafstoting, afwezigheid van endotheelafstoting, lager endotheelcelverlies en gunstige kosteneffectiviteitsratio 6,7,8,9,10,11 . DALK maakt het verder mogelijk om hoornvliezen met een minder dan optimale endotheelkwaliteit te gebruiken als grafts, omdat deze aangetaste laag niet zal worden getransplanteerd12. Omgekeerd is de kwaliteit van het donorvliesstroma waarschijnlijk de belangrijkste beperkende factor voor het succes van het transplantaat en het herstel van het gezichtsvermogen, omdat het stroma de enige donorhoornvlieslaag is die overblijft, terwijl het donorepitheel zal worden vervangen door ontvangend epitheel. Helaas zijn de middelen om het hoornvliesstroma van de donor in oogbanken te beoordelen beperkt. Ze omvatten meestal spleetlamponderzoek van de donoroogbol wanneer weefselopvraging wordt uitgevoerd door enucleatie en lichtmicroscooponderzoek van het donorstroma13. Sommige oogbanken zijn begonnen met het aanvullen van dergelijke standaardprocedures met behulp van Fourier-domein optische coherentietomografie (FD-OCT)14.
Oftalmische optische coherentietomografie (OCT), een optisch analoog aan echografie15, maakt gebruik van interferentie van breedband of afstembaar licht om optische secties van het netvlies 16 en het voorste segment17 te genereren. In tijdsdomein OCT, de basis van vroege klinische systemen, wordt de positie van een referentiespiegel gewijzigd, zodat interferentiepatronen verschijnen wanneer de referentiebundel bijna dezelfde hoeveelheid tijd heeft afgelegd als de bundel die wordt gereflecteerd op de verschillende weefselinterfaces, waarbij A-scans worden gegenereerd als functie van de tijd. In FD-OCT (ook wel spectraal- of frequentiedomein OCT genoemd), de basis van de meeste moderne klinische systemen, wordt de referentiespiegel op één positie gefixeerd en wordt een individuele A-scan, met alle interferentiepatronen door elkaar, per keer verkregen en uit elkaar ontleed via Fourier-analyse.
Hoewel klinische (tijd- of spectraal-domein) OCT-systemen dwarsdoorsnedes van het hoornvlies en de detectie van stromale opaciteiten met een hogere axiale resolutie dan spleetlampbiomicroscopie mogelijk maken, is hun laterale resolutie beperkt. Confocale microscopie18 maakt onderzoek van het hoornvlies mogelijk met een laterale resolutie die histologisch detail benadert, maar is axiaal beperkt.
Full-field optische coherentie tomografische microscopie (FF-OCT of FF-OCM)19,20 combineert elementen van zowel confocale microscopie als OCT, waardoor een laterale resolutie wordt bereikt die vergelijkbaar is met de axiale resolutie van ongeveer 1 μm. Meer specifiek maakt FF-OCM gebruik van onsamenhangende breedbandlichtbronnen (bijv. een halogeenlamp) en optica met een hoog numeriek diafragma om 2D-tomografische beelden te verkrijgen zonder laterale scanning. Door in de diepterichting te scannen, maakt FF-OCM niet-invasieve 3D-beeldvorming van verse of vaste ex vivo biologische weefselmonsters mogelijk. Het is gebruikt om het hoornvlies21,22,23 in beeld te brengen. Door zowel hoge resolutie en face als cross-sectionele weergaven te bieden, biedt FF-OCM informatie over zowel de histologische structuur als cellulaire details van het hoornvlies. In feite is aangetoond dat FF-OCM structurele informatie biedt die superieur is aan histologie en was in staat om meer ziekte-indicatoren te identificeren zoals mogelijk was met de combinatie van spectraal-domein OCT en confocale microscopie24,25.
Hier beschrijven we een protocol voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van corneadonorstroma met behulp van FF-OCM. De methode is gebaseerd op de histologie-achtige analyse van macroscopische en microscopische kenmerken die wijzen op stromale toestand, waaronder drie kwantitatieve stromale parameters (d.w.z. Bowman’s laagdikte en zijn variabiliteit, en stromale reflectiviteit). Het beschreven protocol wordt daarom toegepast op normale en abnormale hoornvliesweefsels en maakt differentiatie van zieke van normale menselijke hoornvliesweefsels mogelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van corneadonorstroma met behulp van FF-OCM is gebaseerd op de histologie-achtige analyse van macroscopische en microscopische kenmerken die wijzen op stromale toestand, buiten de mogelijkheden van spectraal-domein OCT en confocale microscopie21,24,25, en maakt differentiatie van zieke van normale menselijke weefsels mogelijk.
Afgezien van een uitstekende endotheelkwaliteitsbeoordeling van menselijke donorhoornvliezen door middel van spiegelmicroscopie, is de beoordeling van stromale kwaliteit een uitdaging in oogbanken, en over het algemeen beperkt tot een grove waarneming met spleetlampbiomicroscopie en / of lichtmicroscopie in de huidige protocollen. Gebrek aan fijne resolutie met bestaande methoden betekent niet alleen dat hoornvliezen met een stromale ziekte kunnen worden geselecteerd die het resultaat van keratoplastiek in gevaar brengen, maar ook dat hoornvliezen kunnen worden afgewezen voor stromale opaciteiten die in feite beperkend zijn voor voorste stroma of epitheelgebieden en nog steeds kunnen worden gebruikt voor endotheelkeratoplastiekprocedures14.
Het huidige oogbankprotocol zou kunnen worden aangevuld met de toevoeging van FF-OCM, dat vanwege zijn superieure resolutie een krachtig en niet-invasief hulpmiddel vormt om de kwaliteitsbeoordeling van het hoornvlies, met name het stroma (inclusief de laag van Bowman), te voltooien. In tegenstelling tot tijdens het onderzoek van de spleetlamp, blijft het transplantaat tijdens de FF-OCM-beeldacquisitie ondergedompeld in een gesloten kamer gevuld met opslagmedium, waardoor het potentiële risico op verontreiniging wordt verminderd.
Voor een succesvolle beeldacquisitie met FF-OCM (zie Materiaaltabel) is het belangrijk dat het microscoopobjectief goed wordt ondergedompeld in de optische gel die bovenop de afdekplaat van de monsterhouder wordt aangebracht (stap 2.2.3). Het wordt verder aanbevolen om de kalibratie van het apparaat regelmatig te controleren, een procedure die ook moet worden uitgevoerd na mislukte automatische aanpassing (stap 2.2.2) en toegankelijk is via “Tools en opties” in de acquisitiesoftware (zie Materiaaltabel). De procedure, waarbij een kalibratiespiegel in de monsterhouder wordt gebruikt, is dezelfde als de gebruikelijke monstervoorbereiding (zie stap 1.2), behalve dat de optische gel op de spiegel moet worden aangebracht voordat de afdekplaat wordt geplaatst.
Een reeks donorhoornvliestransplantaten, die volgens de bestaande oogbankprocedures als normaal stroma worden beschouwd, werden gebruikt om het protocol in dit manuscript te beschrijven en specifiek de geschiktheid van FF-OCM aan te tonen voor een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van de donorstromale kwaliteit. Deze normale donorhoornvliezen werden vergeleken met pathologische hoornvliezen ondergedompeld in opslagmedium, waaruit blijkt dat de histologie-achtige analyse die mogelijk is gemaakt met FF-OCM van verschillende stromale kenmerken (geïllustreerd in figuur 2, figuur 3, figuur 4, figuur 5, figuur 6, figuur 7 en figuur 8) in hoornvliestransplantaten het mogelijk maakt om zieke van normale menselijke hoornvliesweefsels te onderscheiden.
Afgezien van morfologische veranderingen, zoals de aanwezigheid van littekens (figuur 5 en figuur 7), fibrotisch weefsel (figuur 8), meren (figuur 2), Vogt striae (figuur 4) of verhoogde stromale zenuwdiameter (figuur 4), zijn typische stromale kenmerken aanwezig in zieke hoornvliezen. Stromale parameters die met name relevant zijn in de stromale kwaliteitsbeoordeling lijken de laagdikte en de variabiliteit van Bowman en de stromale reflectiviteit te zijn. Kritische stappen binnen het protocol zijn dus stappen 4.1 en 4.3.
Terwijl het wordt uitgescheiden tijdens de ontwikkeling van het menselijk hoornvlies, wordt met name de laag van Bowman onderscheiden door 19 weken zwangerschap en herstelt nooit na de geboorte32. Schade aan de laag van Bowman is dus onomkeerbaar en dient als een ideale indicator van eerdere stromale schade in donorhoornvliesweefsel, inclusief schade veroorzaakt door refractieve chirurgie, infectieuze keratitis, keratoconus. Dergelijke hoornvliesaandoeningen, die contra-indicaties vormen voor het gebruik van het hoornvlies van donoren, zijn geassocieerd met een verminderde en variabele laagdikte van Bowman als gevolg van onderbreking en littekens (figuur 5) en zullen waarschijnlijk worden gemist door de huidige oogbankprotocollen wanneer de donorgeschiedenis niet precies bekend is.
Hoewel de transparantie van het hoornvlies na donorsterfte wordt aangetast als gevolg van post mortem cornea-oedeem, zal de hoeveelheid teruggekaatst licht of stromale reflectiviteit naar verwachting exponentieel afnemen met de diepte in het stroma (zie figuur 3 es figuur 4A); als gevolg hiervan zal de logaritme van genormaliseerde stromale reflectiviteit een lineaire functie zijn van stromale diepte in normale donorhoornvliezen, weergegeven door R-kwadraatwaarden dicht bij 1. Omgekeerd is de aanwezigheid van macroscopische kenmerken geassocieerd met niet-lineaire logaritmische diepteprofielen en indicatief voor stromale ziekte (figuur 4B es figuur 7)25.
Aangezien keratocytendichtheid verantwoordelijk is voor de synthese en vernieuwing van stromale collageenfibril en extracellulaire matrix, lijkt het redelijk om aan te nemen dat keratocytendichtheid een andere relevante parameter is voor het beoordelen van de donorstromale kwaliteit, en dat weefsels met een zeer laag aantal keratocyten niet mogen worden getransplanteerd. Het protocol bevat daarom een nauwkeurige en betrouwbare methode om keratocytendichtheid te meten uit FF-OCM-beelden die gemakkelijk kunnen worden gebruikt in oogbanken25 en volgt de conventie van confocale microscopie. Merk op dat met FF-OCM de keratocytendichtheid ook kan worden bepaald door keratocyten direct in de dwarsdoorsnedete tellen 33, een potentieel voordeel ten opzichte van confocale microscopie, waarbij keratocyten op meerdere en face slices moeten worden geteld. In tegenstelling tot bij levende patiënten, waar is aangetoond dat de keratocytendichtheden lager zijn bij ziektepatiënten dan bij normale controles 34,35,36,37 en correleren met de ernst van de ziekte 34,38, was dit echter niet het geval bij menselijke ex vivo weefselmonsters 25 , en verdere studies zijn nodig om te bepalen of een minimaal aantal keratocyten nodig is in donorhoornvliezen om te resulteren in een goed visueel herstel na transplantatie. Lage keratocytendichtheid in donorweefsel zoals in pathologisch weefsel kan worden verklaard door veroudering, post mortem verlies van cellen geïnduceerd door ischemie en/of opslag van donorweefsel 27,39,40,41. Er moet ook op worden gewezen dat de normale donorhoornvliezen die in dit protocol werden verkregen en afgebeeld, ofwel werden opgeslagen en oedemateus of opgezwollen waren, of vóór transplantatie door de oogbank waren weggegooid vanwege slechte endotheelkwaliteit volgens de normen van de EU Eye Bank Association. Als FF-OCM-beeldvorming samen met het beschreven protocol zou worden opgenomen in de oogbankinstelling, zouden de hoornvliezen meestal in een frissere toestand worden beoordeeld dan hier mogelijk was, wat de keratocytendichtheden kan beïnvloeden.
Het hier beschreven protocol voor de stromale kwaliteitsanalyse zou kunnen worden uitgebreid voor de beoordeling van het membraan van Descemet, wat ook kan worden opgelost met FF-OCM in termen van dikte en structuur21,24. Dit kan nuttig zijn voor de selectie van weefsels voor Descemet’s membraan endotheliale keratoplastiek, waar dunne Descemet’s membranen moeilijker te scheiden zijn van het stroma.
Kortom, FF-OCM maakt een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van het hoornvliesstroma van de menselijke donor tijdens de opslag mogelijk. Door de kwaliteit van het transplantaat te verbeteren, heeft de toevoeging van dit protocol aan de huidige oogbankprocedures het potentieel om de screening en selectie van donorweefsels, en dus de resultaten van keratoplastiek, te verbeteren. Real-life integratie van het FF-OCM-apparaat in de oogbankroutine moet worden vergemakkelijkt door recente technologische updates, waaronder snellere beeldacquisitie en een groter gezichtsveld dankzij de ontwikkeling van een aangepaste CMOS-camera en het ontwerp van aangepaste steriele wegwerpcassettes voor hoornvliesopslag en -verwerking tijdens beeldvorming.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is gefinancierd door het Agence Nationale de Recherche (ANR), in het kader van een PRTS-subsidie (Projet de Recherche Translationelle en Santé) nr. ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) en uit het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 709104 (K.I.). De auteurs bedanken Céline de Sousa voor haar hulp bij het tellen van cellen en histologische verwerking.
Materials
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
Referencias
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment. Br J Ophthalmol. 96, 614-618 (2010).
- Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
- Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
- Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
- Amayem, A. F., Anwar, M. Fluid lamellar keratoplasty in keratoconus. Ophthalmology. 107, 76-79 (2000).
- Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
- Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
- Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
- Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
- Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
- Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
- Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
- Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H. Full-field optical coherence microscopy. Opt Lett. 23, 244-246 (1998).
- Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
- Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
- Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202 (2007).
- Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006 (2010).
- Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
- Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
- Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
- Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
- Tech, L. L. . , (2017).
- Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
- Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
- Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
- Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
- Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
- Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
- Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
- Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A. Konfokale In-vivo-Hornhautmikroskopie nach Keratoplastik. Ophthalmology. 102, 140-146 (2005).
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
- Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
- Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).
