Summary

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

Published: February 27, 2018
doi:

Summary

Een methode is beschreven voor fractionering van onoplosbare en oplosbare mutant huntingtin soorten van muis hersenen en cel cultuur. De beschreven methode is nuttig voor karakterisering en kwantificering van het huntingtin eiwit flux en aids in het analyseren van eiwitten homeostase in de pathogenese van de ziekte en in het bijzijn van verstoringen

Abstract

De accumulatie van misfolded eiwitten staat centraal in de pathologie in de ziekte van Huntington (HD) en vele andere neurodegeneratieve aandoeningen. Met name is een pathologische spil van HD de afwijkende accumulatie van mutant HTT (mHTT) eiwit in ultrahoog moleculair gewicht complexen en intracellulaire opneming organen samengesteld van fragmenten en andere eiwitten. Conventionele methodes voor het meten en begrijpen dat de bijdragen van verschillende vormen van mHTT-bevattende aggregaten zijn fluorescentie microscopie, westelijke vlekkenanalyse en filter overlappen testen.

Meeste van deze methoden zijn echter conformatie specifiek, en daarom kan niet kunt oplossen door de volledige staat van mHTT eiwit flux vanwege de complexe aard van de totale oplosbaarheid en resolutie.

Voor de identificatie van geaggregeerde mHTT verschillende complexen en aangepaste formulieren is scheiding en solubilisatie van de cellulaire aggregaten en fragmenten verplicht. Hier beschrijven we een methode om te isoleren en visualiseren van oplosbare mHTT monomeren, oligomeren, fragmenten en een onoplosbare ultrahoog moleculair gewicht (HMW) geaccumuleerde mHTT soorten. HMW mHTT bijgehouden met de progressie van de ziekte, komt overeen met muis gedrag uitlezingen en heeft geweest beneficiair gemoduleerd door bepaalde therapeutische interventies1. Deze aanpak kan worden gebruikt met muis hersenen en perifere weefsels celkweek maar kan worden aangepast aan andere modelsystemen of ziekte contexten.

Introduction

De verstoring van eiwit kwaliteitscontrole netwerken, zodat het juiste vouwen en aantasting van de cellulaire eiwitten is waarschijnlijk centraal in de pathologie in de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), en andere “eiwit misfolding” stoornissen2,3. Een gedetailleerd inzicht in de proteostasis-netwerkonderdelen en hun bijdragen aan de pathologie zijn daarom cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. HD wordt veroorzaakt door de abnormale groei van een herhaling van het CAG binnen het HD-gen wat resulteert in een uitgebreid stuk van polyglutamines (polyQ) in het eiwit huntingtin (HTT)4. Een consistente pathologische functie van HD pathogenese is de resulterende misfolding, accumulatie en aggregatie van HTT in gebieden van de hersenen en perifere weefsels, waarvan is aangetoond te bemoeien op verschillende manieren met de normale cel homeostase en functie 5 , 6. terwijl HTT overal wordt uitgedrukt, middellange Maxomys neuronen in het striatum zijn selectief kwetsbare en meest openlijk waarin dit probleem optreedt met opmerkelijke corticale atrofie ook geassocieerd met HD pathogenese.

De vorming van aggregaten van HTT in de hersenen van HD patiënten en diermodellen heeft meestal geserveerd als een proxy-marker van progressie van de ziekte en dominant-negatieve winst van functie voor mHTT7. Hoewel de precieze mechanismen door welke proteïne misfolding en aggregatie aan mHTT-geïnduceerde toxiciteit bijdragen kunnen onduidelijk blijven, is de vorming van deze insluitsels in de hersenen van HD patiënten en verschillende diermodellen een invariant en onvermijdelijke functie. Insluitsels lijken te bestaan grotendeels uit geaccumuleerde HTT fragmenten met de N-terminal uitgebreid polyQ, die aangeeft dat proteolyse en verwerking van full-length HTT evenals alternatieve splicing8,9 kan spelen een belangrijke rol in de pathogenese van HD. N-terminale HTT fragmenten kan vormen een pathologische vorm van HTT die kan snel aggregaat, ervoor, en versnellen of propageren de aggregatie proces10.

De aanwezigheid van deze insluitsels doet echter niet noodzakelijkerwijs met HTT-geïnduceerde toxiciteit of cel dood11correleren. HTT wordt voorgesteld te ondergaan het proces van een samenvoeging van een oplosbare monomeer door oplosbare oligomere soorten en β-sheet fibrillen tot onoplosbare aggregaten en insluitsels12. Oplossen van deze verschillende eiwit soorten via standaard biochemische tests is een uitdaging op het gebied als gevolg van hun stabiliteit in lage-wasmiddel lysis-buffermengsel en moeilijkheden in het visualiseren met behulp van standaard biochemische tests. Methodologische overwegingen zijn dus cruciaal voor het opsporen van de mate en het patroon van opgebouwde en geaggregeerde mHTT.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode om te visualiseren van verschillende tussenproducten van HTT, specifiek de vorming van een onoplosbare HMW HTT-soorten, die lijkt te nauw track met HD pathogenese en ziekte progressie1,13 ,14. Zijnde kundig voor oplossen en het bijhouden van meerdere soorten mHTT biedt onderzoekers een biochemische instrument om te studeren van de pathogenese van de ziekte en het evalueren van potentiële therapeutische interventies door hun modulatie en het effect op de pathogenese van de ziekte.

Protocol

Dierlijke ethiek verklaring – experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health en een goedgekeurde dierlijke onderzoeksprotocol door de institutionele Animal Care en gebruik Comité ( IACUC) aan de Universiteit van Californië, Irvine, een AAALAC geaccrediteerde instelling. Alle inspanningen waren geleverd om te minimaliseren van dierenleed. 1. bereiding van Lysis Buffers Bereiden “…

Representative Results

Resolutie van oplosbare en onoplosbare cel lysates na fractionering kan worden opgespoord met behulp van westerse analyse en filter retardatie assays (Figuur 2). Als voorbeeld, HEK293T cellen werden transfected met behulp van transfectiereagens (b.v., lipofectamine 2000) met HTT exon 1 coderen cDNA met 97 glutamine herhaalt15 gevolgd door de poly proline rijke regio en deze cellen mochten uitdrukkelijke voor 44 h. cellen werde…

Discussion

Enkele voorzorgsmaatregelen zijn nodig voor de bovenstaande protocollen om ervoor te zorgen consequent en kwantitatieve resultaten. Eerst, mHTT in beide breuken spontaan zal aggregaten vormen na verloop van tijd op meerdere bevriezen dooi cycli, met name bij een hoge concentratie. Het is dus cruciaal voor aliquots van het eiwit preps bevriezen en ontdooien alleen het benodigde volume voordat u de test uitvoert zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Verder, als onoplosbare breuk resulteert in witte neerslaande bij…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de NIH (RO1-NS090390). Wij zouden ook willen bedanken Dr. Joan Steffanfor technische bijstand en discussie tijdens de ontwikkeling van deze test.

Materials

Sterile Filter Millipore SCGP505RE Screw cap, sterile vaccum filter
1 mL Tissue Grinder, Dounce Wheaton 357538
Sonicator Qsonica Model Q125
DC Protein Assay Biorad 5000111 Comparable to Lowry assay
Tris 1M buffer solution Alfa Aesar J60636
Triton X-100 Fisher BP151-100
NaCl 5M solution Teknova S0251
Glycerol Fisher BP229-1
20% SDS solution Teknova S0295
N-ethylmaleimide Sigma E1271
Phenylmethylsulfony flouride Sigma P7626 create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C
Sodium orthovanadate Sigma S6508 Create 0.5M stock solution in water
Leupeptin Sigma L2884 Create 10mg/ml stock solution in water
Aprotinin Sigma A1153 Create 10mg/ml stock solution in water
Sodium Fluoride Sigma S4504 Create 500mM stock solution in water
Anti-HTT Millipore MAB5492 Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay
Anti-GAPDH Novus Biologicals NB100-56875 Use 1:1000 for soluble western blot

Referencias

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington’s Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington’s disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington’s disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington’s disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington’s disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington’s Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington’s disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington’s disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington’s disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington’s Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O’Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington’s disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC’s tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

Play Video

Citar este artículo
Ochaba, J., Morozko, E. L., O’Rourke, J. G., Thompson, L. M. Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species. J. Vis. Exp. (132), e57082, doi:10.3791/57082 (2018).

View Video