Summary

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Published: December 09, 2017
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Summary

Expansão do código genético serve como uma ferramenta poderosa para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo acetilação de proteínas. Aqui vamos demonstrar um protocolo fácil de explorar esta técnica para gerar homogeneamente acetilado proteínas em locais específicos em células de Escherichia coli .

Abstract

Modificações borne-translational que ocorrem em posições específicas das proteínas foram mostradas para desempenhar um papel importante em uma variedade de processos celulares. Entre eles, a acetilação reversível lisina é um do mais amplamente distribuído em todos os domínios da vida. Apesar de numerosos estudos de espectrometria de massa-baseado acetylome foram realizados, ainda mais, caracterização dessas metas de acetilação putativo tem sido limitada. Uma razão possível é que é difícil gerar proteínas puramente acetiladas em posições desejadas pela maioria das abordagens bioquímicas clássicas. Para superar este desafio, a técnica de expansão do código genético foi aplicada para usar o par de uma variante do engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetase e seu tRNA cognatos de espécies de Methanosarcinaceae , para dirigir a incorporação de cotranslational de acetyllysine no site específico da proteína de interesse. Após a primeira aplicação no estudo de acetilação da histona, esta abordagem tem facilitado a estudos de acetilação em uma variedade de proteínas. Neste trabalho, temos demonstrado um protocolo facile para produzir proteínas site-specifically acetificadas usando a bactéria modelo Escherichia coli como o anfitrião. Malato desidrogenase foi usado como um exemplo de demonstração neste trabalho.

Introduction

Modificações borne-translational (PTMs) de proteínas ocorrerem após o processo de tradução e surgem de adição covalente de grupos funcionais para resíduos de aminoácidos, desempenhando papéis importantes em quase todos os processos biológicos, incluindo o gene transcrição, resposta ao estresse, diferenciação celular e metabolismo1,2,3. Até à data, cerca de 400 distintivo PTMs foram identificados4. A complexidade do genoma e a proteoma é amplificada em grande medida por PTMs de proteína, como regular a localização e atividade da proteína e afetam a interação com outras moléculas tais como proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e cofactores5.

Acetilação de proteínas tem estado na vanguarda dos estudos PTMs nas últimas duas décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilação de lisina foi descoberta em histonas há mais de 50 anos13,14, tem sido bem analisadas e é conhecida por existir em mais de 80 fatores de transcrição, reguladores e várias proteínas15, 16,17. Estudos na acetilação de proteínas não apenas nos proporcionou uma compreensão mais profunda de seus mecanismos reguladores, mas também guiada tratamentos para uma série de doenças causadas por acetilação disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. acreditava-se que a acetilação de lisina só acontece nos eucariontes, mas estudos recentes têm mostrado que acetilação de proteínas também desempenha papéis-chave na fisiologia bacteriana, incluindo a quimiotaxia, resistência ácida, ativação e estabilização do Ilhas de patogenicidade e virulência outra relacionadas com proteínas24,25,26,,27,28,29.

Um método comumente usado para caracterizar bioquimicamente acetilação de lisina é usando o mutagenesis local-dirigido. Glutamina é usada como um mímico de acetyllysine por causa de seu tamanho semelhante e polaridade. Arginina é utilizada como uma mímica de lisina não-acetilado, uma vez que preserva a sua carga positiva sob condições fisiológicas, mas não pode ser acetilado. No entanto, ambos imita não é isosteres real e não sempre produzir os resultados esperados30. A abordagem mais rigorosa é gerar proteínas homogeneamente acetiladas em resíduos de lisina específica, que é difícil ou impossível para métodos mais clássicos, devido a baixa estequiometria da acetilação de lisina na natureza7,11. Este desafio tem sido desvendado pela estratégia de expansão de código genético, que emprega uma engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetasePyl com acetyllysine, variante de Methanosarcinaceae espécie de cobrar tRNA que utiliza o host translacional máquinas para suprimir o UAG parar códon no mRNA e direciona a incorporação de acetyllysine na posição projetada da proteína alvo31. Recentemente, otimizamos o sistema com uma melhoria de tRNA EF-Tu-ligação32 e um atualizado acetyllysyl-tRNA sintetase33. Além disso, temos aplicado este sistema de incorporação reforçada em estudos de acetilação da malato desidrogenase34 e correntes-tRNA sintetase35. Aqui, demonstramos o protocolo para gerar proteínas puramente acetiladas da clonagem molecular para identificação bioquímica usando malato desidrogenase (MDH), que temos estudado extensivamente como um exemplo demonstrativo.

Protocol

1. site-Directed Mutagenesis do Gene alvo Nota: O MDH é expressa sob promotor T7 no vetor com a origem de CloDF13 e um número de cópia de 20 a 4034 pCDF-1 . Introduzir o códon âmbar para na posição 140 no gene por Cartilhas (encaminhar cartilha: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverter a primeira demão: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguindo as instruções do kit mutagenesis local-dirigido. Amplificar …

Representative Results

O rendimento de proteína MDH acetilado foi 15 mg por cultura de 1 L, enquanto que do selvagem-tipo MDH foi 31 mg / cultura de 1 L. Proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE, conforme mostrado na Figura 1. O selvagem-tipo MDH foi usado como um controle positivo34. A proteína purificada de células de abrigar o sistema de incorporação de acetyllysine (AcK) e o gene mutante mdh , mas sem AcK em meios de crescimento…

Discussion

A incorporação genética de aminoácidos não-canônico (ncAAs) baseia-se a supressão de um codão atribuído, principalmente o âmbar stop códon UAG36,37,38,39, pelo tRNA ncAA-carregada contendo o anticodão correspondente. Como é sabido, o códon UAG é reconhecido pelo lançamento factor-1 (RF1) em bactérias, e isso pode também ser suprimido por perto os tRNAs cognata de hosts cobrado…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH (AI119813), o arranque da Universidade de Arkansas e o prêmio do Instituto de Biociências de Arkansas.

Materials

Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

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Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

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