Summary

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Published: March 02, 2018
doi:

Summary

Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.

Abstract

Polymorphkernigen Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel (PMN)-m/s) sind Lipid Bilayer, sphärische Microvesicles mit Größen von 50 – 1.000 nm im Durchmesser. M/s sind eine sich neu entwickelnden, wichtiger Bestandteil der Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung Maschinen. Wegen ihrer Größe und der Art ihrer Freisetzung wurde bis vor kurzem MP Existenz übersehen. Allerdings ist ihre Funktion in Gesundheit und Krankheit mit verbesserter Technik und analytischen Methoden jetzt entstehen. Die hier vorgestellten Protokolle richten sich an Isolierung und Charakterisierung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie und Immunoblotting. Darüber hinaus sind einige Umsetzungsbeispiele gegeben. Diese Protokolle für MP Isolierung sind schnelle, kostengünstige und nicht den Einsatz von teuren Kits erfordern. Darüber hinaus sorgen sie für die Kennzeichnung von MPs nach Isolierung, sowie Pre-Kennzeichnung der Quellzellen vor MP Version mit einem Membran-spezifische Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung und Analyse von Durchflusszytometrie. Diese Methoden haben jedoch mehrere Einschränkungen einschließlich Reinheit von PMNs und m/s und die Notwendigkeit für anspruchsvolle analytische Instrumentierung. Ein High-End-Durchflusszytometer muss zuverlässig analysieren MPs und minimieren falsche positive liest wegen Lärm oder Auto-Fluoreszenz. Die beschriebenen Protokolle können verwendet werden, zu isolieren und MP Biogenese definieren und charakterisieren ihre Markierungen und Variation der Zusammensetzung unter anderen stimulierenden Bedingungen. Größe Heterogenität kann ausgenutzt werden, um zu untersuchen, ob der Inhalt der Membran Partikel versus Exosomen anders ist, und ob sie unterschiedliche Rollen im Gewebe Homöostase zu erfüllen. Zu guter Letzt können folgende Isolierung und Charakterisierung von MPs, ihre Funktion im zellulären Reaktionen und verschiedenen Krankheitsmodelle (einschließlich, PMN-assoziierten entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. entzündliche Darmerkrankungen oder akuten Lungenversagen) erkundet werden.

Introduction

Vor kurzem, “Mikropartikel/Microvesicles” aus dem Zytosol der Zelle oder Plasmamembran geworden von großem wissenschaftlichen Interesse, da neue Daten deuten darauf hin, dass diese Strukturen, angefangen bei 50-1.000 nm im Durchmesser, biologische Informationen enthalten können und als eine nicht-kanonische Methode der zellulären Kommunikation dienen. Immune Zelle abgeleitet MPs und besonders die von polymorphkernigen Neutrophilen (PMNs) sind von großem Interesse angesichts der wichtigen Rolle von PMNs in Host Verteidigung1,2, Entzündungsreaktionen3und Wundheilung 4. faszinierend, so weit, haben zahlreiche Berichte Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen von PMN-MPs5, was auf einen möglichen Kontext-, Krankheit – Arten- und Organ-spezifischen Rolle des m/s gezeigt.

In dieser Mitteilung beschriebenen Protokolle bieten eine kostengünstige, innovative und flexible Methode, um die Funktion des MPs in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Sie sind auf vielen Modellorganismen, Organe und Stimulation Bedingungen anwendbar. Sie ermöglichen die Identifizierung von mehreren Arten von m/s und können in Zukunft verwendet werden, um ihre Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen. Als ein Beispiel beschrieben hier ist, wie man die Funktion von PMN-MPs in epithelialen Wunde heilen in Vitro und in Vivozu untersuchen. Die vorgestellten Protokoll zur Isolierung der Maus Knochenmark stammenden PMNs wurde mit einigen Änderungen von einem zuvor beschriebenen Methode6angepasst.

Darüber hinaus Protokolle in dieser Studie beschriebenen ermöglichen die Erkennung und Charakterisierung von spezifischen Marker, die auf PMN-MPs durch zwei komplementäre Methoden finden: Western blot und flow Cytometry. Wir finden, dass Immunoblotting der MPs mit Standardprotokollen5 ist einfach und zuverlässig, jüngste Fortschritte in der Empfindlichkeit der Flow Cytometry Instrumente und verbesserte Rauschsignal-Verhältnis jetzt können jedoch zur weiteren Analyse des MPs mit dieser Methode. Die beschriebenen Protokolle in dieser Studie zu integrieren, die jüngsten Fortschritte und Empfehlungen von original Forschungsartikel, einschließlich Änderungen an Zentrifugation Geschwindigkeit und Zeit, die Zugabe von Probe Filter- und Einfrieren/Lagerung Bedingungen7 , 8, und wie man das “Hintergrundrauschen” reduzieren, verbessern die Nachweisgrenze von PMN-MPs und unterscheiden können zwischen verschiedenen Größen der MPs.

Protocol

Alle tierische Arbeit wurde von der nordwestlichen IACUC genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien abgeschlossen. Für Probanden Blut zu Spenden wurde eine Einverständniserklärung vorgelegt und unterzeichnet; Darüber hinaus wurden alle Probanden in dieser Studie nach den institutionellen und Bundesrepublik Leitlinien für menschliches Wohlergehen behandelt. Hinweis: Die Protokoll-Schritte sind unte…

Representative Results

Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse von MPs, das wurden isoliert von Mensch und Maus PMNs sind in Abbildung 1dargestellt. Die Größe Heterogenität der PMN-MPs im Vergleich zu bekannten großen Perlen wie in Abbildung 1A, B für menschliche MPs. Note bewertet werden kann, wurden keine signifikanten Unterschiede in Größe Heterogenität zwischen Maus und Mensch MPs beobachtet. Ebenso kann mit Durchf…

Discussion

Protokolle für die Isolierung und Charakterisierung von PMN-abgeleitete MPs werden in dieser Mitteilung beschrieben. Mehrere wichtige kritische Punkte müssen für den Erfolg des Verfahrens berücksichtigt werden. Erstens muss PMNs frisch isoliert und in Experimenten innerhalb 2 h der Isolation verwendet, um zu verhindern, dass die spontane Aktivierung und Degranulation. Alle Behandlung der PMNs während Isolierung und bis zu dem Punkt der Stimulation muss auf Eis, Aktivierung und vorzeitige MP Version

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar für die technische Hilfeleistung des Dr. Suchitra Swaminathan, die den nordwestlichen Feinberg School der Medizin Flow Cytometry Kern läuft. Finanzierung sorgte (NIH) DK101675.

Materials

DMEM Corning 10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) Atlanta Biologics S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140
0.5 M EDTA Fisher BP2482
Sodium chloride Sigma S9888 Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof) Decon labs 2701
HBBS Corning 21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4% Sigma T8154 SIGMA Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane Abbot 50033
Anti-human CD11b-APC conjugated Biolegend 301350 Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL Invitrogen B10250 N-(2-aminoethyl) maleimide 
Annexin V Binding Buffer Biolegend 422201
Calibration Beads for Flow Cytometry BioCytex 7803
FITC Annexin V Biolegend 640906
Polymorphprep Axis-Shield PoC AS Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes Corning 430053
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B
Pasteur pipettes  BD Falcon 357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122
100 µm cell strainers Celltreat 229485
Vacutainer tubes BD 367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) BD (SORP)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific 75007210
Ultracentrifuge Beckman (L8-80 M)
Micro-centrifuge ThermoFisher Scientific  VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific  75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm Storz 27071zj
Software
Image J National Institute of Health Open source 

Referencias

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Finkielsztein, A., Mascarenhas, L., Butin-Israeli, V., Sumagin, R. Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e56949, doi:10.3791/56949 (2018).

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