백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

실험은 남성 쥐 나이에 라인 지방 팔 라틴 (승인 번호 23 177-07/G12-1-002 및 23 177-07/G15-1-051)에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인 아래 오래 된 8 ~ 12 주에 실시 했다. 1. 마우스 마 취 및 수술 준비 수술 전에 좋은 건강 및 동물의 상태를 확인 합니다. 수술 전에 체중, 음식, 및 물 소비 (모양, 자세, 자연 스러운 행동) 그들의 일반적인 조건에 대 한 2-3 일 동안 하루에 한 번씩 동물을 모니터링 합니다. 준비 마스터 믹스 midazolam (5 mg/kg 체중), medetomidine (0.5 mg/kg 체중), 펜타닐 (0.05 mg/kg 몸 무게)와 마 취에 대 한 intraperitoneally (i.p.) 26 G 바늘 200 µ L/30 g 마우스 1 mL 주사기에 주입. 삼 투 펌프 주입 및 IVM 실험 동물 준비 플랫폼 온난화 39 ° c는 작업 필드에 수행 됩니다. 소독 목욕에 모든 도구를 소독 하 고 소독 온난화 플랫폼. 절차 동안 눈 연 고와 동물 눈을 보호 합니다. 삼 투 펌프 주입 전에 면도기와 모피를 제거 합니다. 제 모 크림, 면봉을 사용 하 여 년 및 jugular 카 테 테 르 주입 IVM 실험에서의 격리에 대 한. 2 피부 소독 제를 사용 하 여 동물의 피부를 소독: 한 살 균 및 살 균 제 povidone 요오드와 한을 포함 하 피부 살 균 포함 octenidine 알코올 기반 솔루션. 반대 flumazenil (0.01 mg/kgbody 중량), atipamezol (0.05 mg/kg 체중)와 마 취 (“antisedan”) 믹스 마스터 믹스를 준비 하 고 피하 것 26 G 바늘 200 µ L/마우스 1 mL 주사기에 준비 (사우스 캐롤라이나) 주입. 2. 삼 투 펌프 준비 및 이식 참고: 삼 투 펌프를 사용 하 여 피하 AngII 주입 Lu 그 외 여러분 에 의해 상세히에서 기술 되었다 17 멸 균 식 염 수와 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여는 AngII를 준비 하 고 농도 동물 무게와 펌프의 배달 속도 조정. 플라스틱 튜브 (유리 튜브를 사용 하지 마십시오.)에서 재구성 된 AngII를 유지. 7 일 동안 1 mg/(kg·d)를 제공 하는 AngII 솔루션으로 펌프를 채우십시오. 준비 후에, 펌프에서에서 계속 4-6 h에 대 한 살 균 염 분 최소 37 ° c. 후면 마 취 혼합의 사출 반사 발 고 따뜻한 작업 필드에는 마우스의 완벽 한 마 취를 테스트 합니다. 마 취 유도 10-15 분 소요 하 고 동물 어두운 환경에서 배치 하는 경우 더 잘 작동 합니다. 마우스 뒷면 하단을 면도 하 고 알콜 피부 살 균 소독. 가 위를 사용 하 여 척추에 수직인 1 cm 절 개를 확인 합니다. 해협 hemostat를 사용 하 여 펌프에 대 한 주머니를 만들고 펌프를 삽입 (먼저 사회자 흐름). 주머니 없는 압력 상처에 펌프의 자유 운동을 허용 해야 합니다. 염증; 제한 하기 위하여 하지 클립, 봉합와 상처를 닫습니다 그런 다음 피부 살 균 소독. Antisedan 믹스의 200 µ L의 사우스 캐롤라이나 주사로 마 취를 반대 하 고 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다. 수술 후 진통 buprenorphine와 수행 (0.075 m g/k g 사우스 캐롤라이나) 한 번 수술 후 및 동물의 행동에 따라 수요에. 3. jugular 카 테 테 르 주입 및 년 준비 마우스의 완벽 한 마 취 주입 마 취의 후면 음식 반사와 혼합 하 고 온도 유지 하 고 연 고를 두고 직장 프로브와 39 ° C에 수술 등 recumbence에서 마 취 동물을 배치 후 테스트 절차 동안 그들을 보호 하기 위해 눈입니다. 제 모 크림을 사용 하 여 목 머리카락을 제거 합니다. 면봉을 사용 하 여 확산 하 고 머리카락 밖으로을 시작 될 때까지 2 분 동안 크림을 문 지 르 세요. 추가 2 분 후 주걱으로 크림과 머리카락을 제거 하 고 알콜 피부 살 균으로 피부를 소독 합니다. 아래는 stereomicroscope 수술을 수행 합니다. 경도 목, 기관지 옆 1 cm에서 피부에 1-1.5 cm 긴 절 개를 확인 합니다. 첫 번째 절 두 사지에 수직으로 다른 두 절을 확인 합니다. 신중 하 게 피부 옆 조직 제거 하 고 피부 왼쪽된 경 정 맥 및 기도의 조각을 제거. 조심 스럽게 분리 귀 밑 샘; 2 곡선된 겸 자에 대 한 관심의 영역에서 설 하 고 submaxillary 땀 샘. 하지 절단 또는 동맥 손상, 경 정 맥에는 년 최고의 액세스할 수 있도록 그들 장소. 경 정 맥을, 얇은 집게를 사용 하 고 천천히 열고 주변 조직에서 혈관을 부드럽게 닫습니다. 일단 정 맥이 완전히 깨끗 한는 겸 그릇 아래 놓고 아래 각 10 cm의 2 개의 7-0 봉합을 배치. 두 개의 매듭을 가진 머리에 인접 봉합을 닫습니다. 다른 봉합에 한 매듭을 준비 하지만 그것을 닫지 마십시오. 잡고 한 손으로 집게와 37 ° C 살 균 염 분 가득한 테 (안쪽 직경, 0.61 m m 외부 직경 0.28 m m) 다른 한편으로는, 함께 하는 동안 얇은 위 또는 곡선된 26 G 바늘 그릇에 작은 절 개를 확인 합니다. 그런 다음 경 정 맥에 카 테 터를 삽입 하 고 두 번 매듭을 닫습니다. 완전 한 동원 정지를 위해 카 테 터를 통해 머리에 인접 봉합을 닫습니다. 격리 하 고 경 동맥을 준비, 얇은 곡선된 겸 자 사용 하 여 기관지를 덮고 영역 해 부. 일단 고 년 조직 주변에서 자유롭다, 선박에서 미주 신경 (흰색 라인은 경 동맥에 인접 한 모양)를 제거 (하지만 그것을 잘라 하지 않습니다). 얇은 포 셉 폐쇄 하 고 천천히 부드럽게 신경을 동원을 열 수 있습니다. 두 동맥은 완전히 깨끗 한, 일단 아래 첫 번째 경 동맥 겸 자 놓고 작은 블랙 3 m m x 폭 2.5 c m 길이 플라스틱 조각 그릇 아래에 배치 합니다. 그것은 매우 중요 한 선박을 overstretch 하지 고 혈액의 흐름은 선박 소유자 배치 되 면 존재 확인. 두 번째 동맥 선박 소유자를 놓습니다. 마우스는 현미경의 밑에 직접 배치 되지 않습니다, 기도에 땀 샘을 다시 넣어 고 37 ° C 살 균 염 분 지 대의 건조 방지를 적용. 4. 압 연 및 백혈구 준수 평가 / LysM + IVM와 세포 -20 ° C에 저장 하는 2 mg/mL 재고 솔루션에서 오렌지 acridine 준비 하 고 그것에 게 1:4 1 mL 주사기에 멸 균 식 염 수 (최종 농도 0.5 mg/mL)에 희석.빛에서 주사기를 보호 하 고 하나의 마우스 당 200 µ L를 사용 하 여. 다른 조건을 테스트: acridine jugular 테;와 오렌지의 (1) 주입 (2) 주입 acridine 오렌지 직접 꼬리 옆 정 맥 (이 조건으로 아무 jugular 테 이식 했다); (3) 측정 acridine 오렌지 형광 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 마우스 (여기 다시 아무 jugular 테 이식 했다) 없이. 일단 테 장소 이며 2 년은, 현미경 마우스를 놓습니다. 장거리 콘덴서와 X 10을 사용 하 여 고속 넓은 필드 형광 현미경으로 측정을 수행 (NA 0.3)는 단색, 빔 스플리터와 전 하 결합 소자 카메라 물 침수 목표. 이미지 수집 및 실시간 이미징 시스템 분석을 수행 합니다. 경 동맥 내 피 표면에 중간 현미경 목표 초점. 천천히 주사 50 µ L의 acridine 오렌지 (0.5 mg/mL) (고려 첫 번째 주입을 위해 카 테 터의 죽은 볼륨). 이미지 당 120 밀리초의 노출 시간 100 이미지 기록 소프트웨어를 설정 합니다. 각 비디오에 대 한 동맥에 다른 위치에서 경 동맥 (왼쪽 및 오른쪽) 당 4 개의 동영상을 확인 합니다. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 또 다른 50 µ L을 주입. 모든 동영상을 녹화 후 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사. 초당 10 이미지 비디오 속도 설정 하 고 각 비디오에 대 한 선박 중앙 배치 200 µ m x 250 µ m 사각형 보기에서 롤링 및 부착 세포 계량. 롤링 및 부착 셀; 부착 세포 이동 하지 않거나 10 s 비디오 내 피에서 분리 된 셀으로 정의 됩니다. 정량화를 단순화 하기 위해 빨간 형광으로 채널을 제거 하 고 롤링 및 접착 셀만 녹색 형광을 사용 합니다. 실험 acridine 오렌지를 사용 하 여, 내 피 세포에 의해 만들어진 배경을 제거 하기 위해 형광의 수동 임계값을 확인 합니다.