极乐, 一个研究木动力学的双重标记协议被开发了。使用合成单体记者和 SPAAC 和 CuAAC bioorthogonal 单击反应的顺序组合, 此方法为深入分析生物木中的底的因素铺平了道路.
木质素是地球上最普遍的生物大分子之一, 也是纤维素生物质的主要成分。这种酚醛聚合物在高等植物的生长和生活中起着重要的结构和保护作用。虽然调节木过程的复杂机制在体内强烈影响许多植物衍生产品的工业稳定, 但科学界仍有很长的路要走去破译它们。在一个简单的三步工作流程中, 本文所提出的双标记协议使 bioimaging 对植物组织的活跃 lignifying 区进行了研究。第一步包括两个独立的化学记者的新陈代谢的合并, 两个本地 monolignols 的代理人, 产生木质素的 H 和 G 单位。在加入生长的木质素聚合物之后, 每位记者通过 bioorthogonal SPAAC/CuAAC 点击反应的顺序组合, 然后用自己的荧光探针进行特殊标记。结合木质素的自发荧光, 这一方法导致三色的植物细胞壁内木质素定位图的生成, 共焦荧光显微镜和提供精确的空间信息的存在或缺乏活动木机械的规模, 植物组织, 细胞和不同的细胞壁层。
在过去的二十年里, 《化学记者战略》已经成为一个强有力的两步法来研究非基因编码生物分子的动力学和功能的方法。1,2,3在该策略中, 生物的一个合成模拟器 (即化学报告器) 首先由生物体进行代谢, 然后是一个化学探针 (e. g, 荧光荧光)共焦显微成像) 是通过 bioorthogonal 点击化学与合并后的记者进行共价键连接的。探针必须快速地和具体地反应对被介绍的化学制品的修改, 而对存在于活系统中的任何生物分子是惰性的。在许多方面, 这种方法克服了常见的 bioconjugation 技术的局限性, 通过使用高度特定的点击化学结扎从而提供了机会跟踪代谢物或大分子以前无法进入在生活系统中4,5,6。
尽管这种强大的方法在细菌和动物细胞中的快速增长的普及, 报告描述它在植物生物学中的使用是惊人的很少和远在7,8,9,10, 11,12。我们特别感兴趣的是在植物中应用这一策略来研究木质素的形成, 这是地球上最普遍的生物大分子之一, 也是纤维素生物质的主要成分。13,14木质素是一种在高等植物的生长和生活中起着重要的结构和保护作用的酚醛聚合物。
它一般由三 4-hydroxyphenylpropanoid 基: H (p羟基苯基), G (guaiacyl) 和 S (syringyl) 单位分别从三 “monolignols” (p-coumaryl, 松柏和 sinapyl 醇) 获得通过细胞胞浆中的丙烷通路合成 (图 1)。在被出口到细胞壁之后, monolignols 被氧化到自由基由过氧化物或漆之后他们接受纯化学的根本耦合反应对聚合对木质素聚合物, 过程被称为木。15,16虽然木强烈影响许多植物衍生产品的工业稳定, 但科学界仍有很长的路要去破译木的复杂机制。
图 1: 植物细胞中的木过程.Monolignols 是 biosynthesized 苯丙氨酸在胞。在被出口到细胞壁之后, monolignols 被氧化到自由基由过氧化物或漆之后他们接受纯化学的根本耦合反应对聚合对木质素聚合物, 过程被称为木。请单击此处查看此图的较大版本.
虽然报告关于使用 bioorthogonal 反应为糖分析是许多,2,3,17他们的应用例子到其他类型的生物分子是较少。bioorthogonal 化学用于木质素 bioimaging 的用途最近才被 Tobimatsu et al.所开创8在拟南芥中, 提供有关将松柏醇替代物纳入木质素聚合物的信息, 其中形成 G 单位、8、9 , 从而展示了概念的证明化学报告策略在这方面是适用的。使用 CuAAC 也说明了使用不同的松柏醇衍生物的几个月后, 布考斯基et al。9但是, 木质素也包含了 H 和 S 单元, 对木过程的更深理解需要更多地了解如何将所有的 monolignols 纳入聚合物中, 以及哪些因素可以控制其组成。这一领域的新进展目前依赖于开发有效的方法, 在生活系统中同时跟踪多个化学记者。尽管一些关于糖的文章在近几年打下了基础18,19,20,21,22, 双标记方法仍然是一个主要的挑战bioorthogonal 化学如果一个可重现的单标记点击协议很难开发, 那么两个独立的化学记者之间的两个相互兼容的 bioorthogonal 反应的双重标记方法更是难上加难。这方面的几个例子, 率先采用了应变促进叠氮化-炔烃加 (SPAAC) 和烯烃-嗪逆电子要求翅果-桤木 (DA存货) 的反应, 研究糖在动物细胞。然而, 我们认为, 由于木质素的结构特征 (由富电子取代的桂型单体组成, 可与电子差反应, 所以在这个应用中, 可能无法保证 DAinv 反应的 bioorthogonality。烯烃, 如嗪探头用于 DAinv 反应), 这可能产生非特定的标签。此外, DA “库存” 反应需要综合难以访问的化学处理, 以及笨重和亲油性, 从而提高了化学品的注册、运输和/或本地化的可能性.记者在体内可能会受到影响。当我们认为, 后者方面是特别相关的, 在点击化学方法的情况下研究木, 我们选择了一个不同的方向, 并制定了一个 Bioorthogonal 结扎成像顺序策略 (极乐) 使用结合应变促进叠氮化-炔烃加 (SPAAC) 和铜催化叠氮化-炔烃加 (CuAAC)在体内.23
这两个反应确实是两个主要的 bioorthogonal 点击反应, 已被用于迄今, 特别是在最近发表的木质素成像的几个例子。8,9我们的双标记策略允许在一个单体的报告器和一个终端炔烃上使用一个叠氮化基团, 这两个化学处理是 i) 不对生物相关结构和 ii) 非常小的大小 (图 2).因此, 这些合成的修改对研究中的生物的物理化学性质的影响降到最低, 从而减少了自然和天然单体基材在运输方面可能存在的差异,代谢率在新陈代谢的并网阶段。虽然 SPAAC 和 CuAAC 的结合似乎非常直观, 乍一看, 它是我们的知识, 只有第二个例子的双重标记使用此策略和第一次应用的结构以外的糖。12,23
图 2: 极乐双标记策略.化学记者 hAZ和 g monolignols 是带有本地 h 和 g 的标记类似物.它们首先被引入外源喂养 (步骤 1) 的细胞壁的生长木质素聚合物中。Cyclooctyne-和叠氮化-功能化荧光探针, 然后依次结扎到合并的记者通过 bioorthogonal 点击化学: SPAAC 反应 (步骤 2) 是高度具体的 HAZ单位, 并在后面的 CuAAC 反应 (步骤 3), 它是特定于 G 的单元 (步骤 3), 从而允许两个记者的特定本地化独立于同一示例中.请单击此处查看此图的较大版本.
我们首先设计并验证了叠氮化标签的单体记者HAZ ( p-coumaryl 醇的代用物和木质素 H 单元的前驱体), 然后制定了极乐双标记策略, 它与以前报告的炔烃标记的G与、9 (松柏醇的代用物和木质素 G 单位的前驱体)。在这个可复制的协议开发了和测试在胡麻, 一个经济上重要植物种类, 双重新陈代谢的并网 HAZ和G在木质中首先达到在顺序 SPAAC/CuAAC 之前标签.在这里, 标记的HAZ单元是第一次明确标记通过SPAAC 结扎的 cyclooctyne 功能化的荧光, 其次是 CuAAC 介导结扎第二个荧光探针在标记G单位。本方法用于研究植物细胞壁内木过程的动态变化, 并可应用于体内, 用于茎横断面、活茎及不同植物种类的幼苗。
如前所述, 本文介绍的双标记极乐协议是 SPAAC/CuAAC 组合在体内1223的第一个示例之一。每一个步骤都经过了彻底的优化和验证, 这是非常重要的, 这两个点击化学标签反应顺序执行是尊重 (即, SPAAC 第一, 其次是 CuAAC)。所有交叉控件都显示, 在应用极乐协议时, 每个标记步骤都是特定的23 : 执行 SPAAC 步骤首先导致HAZ叠氮化函数的高度选择性标记。cyclooctyne-官能化荧光通过 [3 + 2] 加反应与快速动力学。一旦HAZ单元被标记, CuAAC 步骤就需要铜 (I) 催化激活G炔烃, 通过与叠氮化-氟545探头的反应生成三唑链.相反, 相反的顺序 (即, CuAAC 第一, 其次是 SPAAC) 不应使用, 因为它导致G与和 HAZ单位交叉耦合, 这与荧光结扎和诱发巨大的信号损失.此外, 还必须强调中间洗涤步骤的必要性, 以避免非特定的染色。
结果表明, 本方法可用于各种生物实验设计。《极乐标记协议》首次应用于亚麻茎秆 (大约150-250 µm 厚) 的徒手横断面上, 这是以前切割和孵化的 monolignols。虽然这种设计的优势是最大限度地减少所需数量的化学记者 (随着孵化量的减少) 和促进统计复制的生产, 它不是严格说来, 一个在体内系统, 并在一些的情况下, 可能不反映所有方面的真实时空木动力学。在第二个实验设计中, 我们因此改编了极乐协议的方法, 以前用于研究标记 monolignols 在松树和银杏27中的加入。在这种方法中, 植物的根和茎是物理分离的, 整个茎的基部在单体溶液中孕育, 这可能被称为 “花瓶” 的方法。在留下茎期望 (潜伏期) 时间之后, 横断面被切开和极乐协议执行。这使我们可以证明 (i), 经改良的 monolignols 是通过活干运输的, 并在细胞壁内生长的木质素聚合物中加入, (ii), 本地化模式与横截面的结构基本相同。方法.这类实验的优点是在实际的活体细胞中进行, 允许更长的实验和更深入的研究, 但需要更多的化学报告。最后, 极乐协议也用于亚麻植物幼苗, 代表一个真正的生活植物模型, 其中化学记者必须通过根部吸收, 然后才被输送到茎。虽然这种模式具有明显的优势, 在活植物中进行, 在实践中, 它是有限的幼苗和不真正适合调查木动力学的老植物的实际原因 (长潜伏期, 高化学记者数量)。然而, 这三实验设计是互补的, 都有他们的利弊有关的实际方面和生物学意义上的类型的生物问题要回答。
为了研究亚麻的木动力学, 我们的协议具有很强的适应性, 不仅在生物实验设计方面, 而且在其他植物种类和器官/组织的应用方面也是如此。例如, 极乐可以很容易地转移到拟南芥或杨树属, 更适合研究与敲出或击倒突变体的各种基因。原则上, 与我们的方法的双重标记研究也可以扩展到其他生物分子通过使用植物细胞壁聚合物的二个不同的被改进的前体-包括所有三主要 monolignols 或他们的新陈代谢的前体并且各种各样构成多糖基质的单糖。自成立以来, bioorthogonal 化学确实主要是通过代谢性寡糖工程 (教育部)4、5、17、28来研究糖/多糖但令人惊讶的是, 目前仅有很少的植物生物学应用,7,8,9,10,11.就反应的相容性而言, 木质素的研究确实是一个复杂的案例, 因为两个化学记者都被纳入同一网状聚合物中。 未标记的Haz–g与跨链路编队的可能性是由于3D 内的 g与和H单元的空间接近而克服的主要问题。木质素的结构23, 如果两个化学记者没有合并到同一类型的生物或任何给定单元的同一空间区域, 则可能不存在此限制。
在更广泛的范围内, 极乐方法可以应用于细菌或动物模型中的任何双色荧光成像研究, 分别使用两个具有叠氮化物和末端炔烃标记的化学记者。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢研究联盟 FRABio 和 TisBio 成像平台 (Univ. 里尔, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des 组合 Biomoléculaires), 为提供有利于实现这一目标的技术环境工作.
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
2% sodium hypochlorite | |||
20 cm high glass tube | |||
250 mL Schott glass bottle | |||
48-well Plate | |||
5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
Aluminium foil | |||
Cheese cloth | |||
Compost containing clay | |||
Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
Milli-Q Ultrapure water | |||
Eppendorf 1,5 mL | |||
EtOH | |||
Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Glass coverslip | |||
Glass microscope slide | |||
Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
Micropipette | |||
Nail polish | |||
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
Plastic cap | |||
Plastic pipette | |||
Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
Razor blade | |||
Rubber band | |||
Sodium Ascorbate | |||
Sterile clamp | |||
Vertical support | |||
Vortex | |||
Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
KH2PO4 | |||
KNO3 | |||
NH4NO3 | |||
MgSO4.7H2O | |||
CaCl2.2H2O | |||
MnSO4.H2O | |||
ZnSO4.7H2O | |||
H3BO3 | |||
KI | |||
Na2MoO4.2H2O | |||
CuSO4.5H2O | |||
CoCl2.6H2O | |||
Na2EDTA.2H2O | |||
FeSO4.7H2O | |||
Thiamine.HCl | |||
Pyridoxine.HCl | |||
Glycine | |||
Nicotinic acid | |||
Myo-inositol | |||
Saccharose | |||
MES hydrate | |||
Agar |