Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Cl&#233;mence Simon; Corentin Spriet; Simon Hawkins; Cedric Lion

doi:10.3791/56947

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Quimica

Визуализация Lignification динамика в растениях с нажмите химия: двойная маркировка, БЛАЖЕНСТВО!

Published: January 26, 2018

doi:

10.3791/56947

Clémence Simon¹, Corentin Spriet¹, Simon Hawkins¹, Cedric Lion¹

¹UGSF – Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, CNRS, UMR 8576,Université de Lille

Summary

БЛИСС, двойной маркировки протокол для изучения lignification динамики, была разработана. Использование синтетических monolignol репортеров и последовательное сочетание SPAAC и CuAAC bioorthogonal нажмите реакций, эта методология открывает путь для углубленного анализа факторов, которые регулируют биогенеза лигнин в planta.

Abstract

Лигнин является одним из наиболее распространенных биополимеры на планете и одним из основных компонентов лигноцеллюлозных биомассы. Этот фенольные полимер играет жизненно важную роль в развитии и жизни высших растений структурных и защитные. Хотя сложные механизмы, регулирующие lignification процессов в естественных условиях сильно воздействие промышленного индексации многих продуктов растительного происхождения, научное сообщество по-прежнему имеет долгий путь к их расшифровать. В простой трехэтапный рабочий процесс двойной маркировки протокола, представленные в настоящем документе позволяет bioimaging исследования активно lignifying зон растительных тканей. Первый шаг состоит в метаболических включение двух независимых химических репортеров, суррогаты двух родной монолигнолов, которые порождают лигнина H – и G-единиц. После включения в растущих лигнина полимеров каждый репортер затем специально помечены с собственной флуоресцентного зонда через последовательные комбинации bioorthogonal SPAAC/CuAAC нажмите реакций. В сочетании с лигнина аутофлюоресценция, этот подход приводит к генерации карты трехцветные локализации лигнина в пределах стены клетки растений конфокальный флуоресцентной микроскопии и обеспечивает точное пространственной информации на наличие или отсутствие активных lignification машины в масштабе растительных тканей, клеток и слои различных клеточной стенки.

Introduction

За последние два десятилетия химические репортер стратегия стала мощный двухступенчатый методологии для изучения динамики и функций-генетически закодированный биомолекул. ¹ ^, ² ^, ³ в этой стратегии синтетический аналог биомолекулы интерес с небольшой модуляции – химическая репортер – первый метаболизируется живого организма, а затем химической зонд (например., Флюорофор для флуоресценции confocal микроскопии изображений) ковалентно связан с встроенный репортер через bioorthogonal нажмите химии. Зонд должны реагировать быстро и конкретно с введена химическая модификация будучи инертен к любой биомолекул, присутствующих в живой системы. Во многих отношениях этот метод преодолевает ограничения общих методов bioconjugation с помощью химии перешнуровок узкоспециализированных нажмите, обеспечивая тем самым возможность отслеживать метаболитов или биомакромолекулах, которые были ранее недоступны в живых систем⁴^,⁵^,⁶.

Несмотря на быстро растущий популярность этого мощного метода в клетках бактерий и животных доклады с описанием его использования в биологии растений удивительно мало и далеко между⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^, ¹¹^,¹². Мы были особенно заинтересованы в применении этой стратегии в растений для изучения формирования лигнина, один из самых распространенных биополимеры на планете и одним из основных компонентов лигноцеллюлозных биомассы. ¹³ ^, ¹⁴ лигнин является фенольные полимер, который играет жизненно важную роль в развитии и жизни высших растений структурных и защитные.

Обычно он состоит из трех 4-hydroxyphenylpropanoid постановление: H (p– hydroxyphenyl), G (guaiacyl) и S (syringyl) единиц соответственно полученных от трех «монолигнолов» (p– каумарильного, Конифериловый и sinapyl спирты), которые синтезирован по дорожке Фенилпропаноиды в цитоплазме клеток (рис. 1). После экспортируется в клеточной стенки, окисляются монолигнолов радикалы пероксидазы или laccases, после чего они проходят чисто химических радикальной муфта реакции для полимеризации лигнина полимеров, процесс называется lignification. ¹⁵ ^, ¹⁶ хотя лигнин сильно влияют на промышленные индексации многих растений, полученных продуктов, научное сообщество все еще имеет длинний путь пойти расшифровать сложных механизмов, регулирующих lignification.

Рисунок 1: процесс lignification в клетках растений. Монолигнолов являются biosynthesized от фенилаланина в цитозоль. После экспортируется в клеточной стенки, окисляются монолигнолов радикалы пероксидазы или laccases, после чего они проходят чисто химических радикальной муфта реакции для полимеризации лигнина полимеров, процесс называется lignification. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Хотя доклады об использовании bioorthogonal реакций для анализа glycan многочисленны,²^,³^,¹⁷ примеры их применения к другим видам биомолекул меньше. Использование bioorthogonal химии лигнина bioimaging целях был лишь недавно впервые, Tobimatsu и др. ⁸ в проростках Arabidopsis thaliana предоставлять информацию о включении Конифериловый Суррогаты алкоголя в полимерные лигнина, где она образует G единиц,⁸^,⁹ , продемонстрировав тем самым доказательство концепции, химические репортер стратегии применимы в данном контексте. Использование CuAAC был также иллюстрируется с помощью различных Конифериловый алкоголя производной несколько месяцев позднее Буковски и др. ⁹ однако, лигнин также содержит H и S единиц и более глубокое понимание процесса lignification требует больше знаний о как все монолигнолов включены в полимера и какие факторы могут контролировать его состав. Новые достижения в этой области в настоящее время зависит от разработки эффективных методологий одновременно отслеживать несколько химических репортеров в живых системах. Даже несмотря на то, что несколько статей о гликанов заложили фундамент в последние годы¹⁸^,¹⁹^,,²⁰^,²¹^,²², двойной маркировки подходы остаются серьезной проблемой в bioorthogonal химия. Если воспроизводимый сингл маркировки нажмите протокол трудно разработать, затем двойной маркировки подходы, которые требуют оптимизации в тандеме два взаимно совместимых bioorthogonal реакции на два отдельных химических журналистам еще сложнее. Несколько примеров, которые впервые этот аспект используется сочетание передовой штамм азид алкины циклоприсоединения (SPAAC) и реакции Дильса-Альдера (да_inv) обратный электронный спроса алкен тетразина для изучения гликанов в животных клетках. Тем не менее мы думали, что bioorthogonality DAinv реакции не может быть гарантировано в этом приложении вследствие структурных особенностей лигнина (который состоит из электронно богатых замещенных Коричный тип мономеров, которые могут реагировать с электрон плохой диенов например тетразина датчики, используемые в DAinv реакциях) и что это может генерировать неспецифичный Этикетировочный. Кроме того, да_inv реакция требует химических маркеров, которые синтетически трудны для доступа, а также громоздкие и липофильных, тем самым повышая возможность что скорость включения, транспорта и/или локализации химического вещества Репортер в естественных условиях могут быть затронуты. Как мы считали, что последний аспект имеет особое значение в случае нажмите химии подход для изучения lignification, мы выбрали различные направления и разработан с использованием Bioorthogonal перевязка Imaging последовательные стратегии (счастье) комбинация Strain-Promoted азид-алкины циклоприсоединения (SPAAC) и катализатором азид-алкины циклоприсоединения меди (CuAAC) в vivo. ²³

Действительно, эти две реакции являются два основных bioorthogonal нажмите реакций, которые использовались до настоящего времени, и в частности в несколько примеров лигнина изображений, недавно были опубликованы. ⁸ ^, ⁹ нашей двойной стратегии маркировки позволяет использовать азид группу на один monolignol репортер и терминала алкины, с другой стороны, два химические дескрипторы, которые i) инертных к биологически соответствующих структур и ii) очень маленький в размер (Рисунок 2 ). В результате воздействия этих синтетических изменения физико-химических свойств биомолекулы исследуемых свернуто, уменьшая возможные расхождения между неестественным и природных monolignol субстратов с точки зрения транспорта и метаболизации ставки на этапе метаболических инкорпорации. Хотя сочетание SPAAC и CuAAC на первый взгляд кажется очень интуитивным, это наши знания только второй пример двойной маркировки с помощью этой стратегии и первое приложение на структуры за исключением гликанов. ¹² ^, ²³

Рисунок 2: BLISS двойной стратегии маркировки. Химические Репортеры H_AZ и G_ALK являются тегами аналогами родной H и G монолигнолов. Сначала они включаются в растущей лигнина полимеров стенок клеток экзогенной кормления (шаг 1). Cyclooctyne – и азид функционализированных флуоресцентных зондов затем последовательно лигируют включены журналистам, bioorthogonal нажмите химии: SPAAC реакции (шаг 2) весьма конкретных единиц H_AZ и сопровождается (реакция CuAAC Шаг 3), конкретных единиц G_ALK (шаг 3), таким образом позволяя конкретные локализации обоих журналистов самостоятельно в том же образце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Мы сначала разработан и проверяются азид меткой monolignol репортер H_AZ (суррогатного алкоголя p– каумарильного) и прекурсоров лигнина H единиц и затем разработать БЛИСС двойной стратегии маркировки в котором он используется в сочетании с ранее сообщалось алкины меткой G_ALK,⁹ (суррогатного алкоголя Конифериловый) и прекурсоров лигнина G единиц. В этот воспроизводимый протокол разработан и испытан в лен экономически важных растений, двойной метаболических включение_AZ Hи G_ALK в лигнина достигается сначала до последовательных SPAAC/CuAAC маркировки. Здесь помеченный H_AZ единицы сначала специально помечены через SPAAC лигирование cyclooctyne функционализированных Флюорофор, затем CuAAC опосредованной лигирование второй флуоресцентного зонда на меткой G_ALKединиц. Этот метод был использован для изучения динамики lignification процессов в пределах стены клетки растений и может быть прикладной в естественных условиях остановить сечений, живущих стебли, а также саженцев различных видов растений.

Protocol

Примечание: Жидких и твердых ½ MS СМИ должны быть готовы заранее, как описано в дополнительной таблице 1. 1. завод культура Культура 2 месяца старый растений льна Сеять семена льна (Linum usitatissimum L.) в пластиковые горшки с помощью заливки компост. Расти льна в камерах роста при 22 ° C с фотопериода 16 h/8 h день/ночь. Оборудовать заводы с вертикальной поддержки после 1 месяца и расти до тех пор, пока они являются 2 месяца старый. Культура, 2 недели старый льна саженцев Оберните 12 семена льна в кусок сыра тканью и исправить с резинкой сделать пучок.Примечание: Выполняют следующие шаги в стерильных условиях под ламинарным потоком вытяжного шкафа. Поместите пакет семян в стеклянной бутылке ранее газобетона 250 мл. Добавить 70 мл 70% EtOH в бутылке и осторожно перемешать за 1 мин. Осторожно удалите EtOH, декантации оставляя пучок в бутылке. Добавить 100 мл 2% гипохлорита натрия и размешать осторожно за 10 мин. Удалите раствор гипохлорита натрия декантации оставляя пучок в бутылке. Повторите шаги 1.2.5-1.2.6. Добавить 100 мл стерильного сверхчистой воды и перемешать на 1 мин. Повторите шаг 1.2.8 3 раза, на увеличение промывки время для каждого полоскания (5, 10 и 15 мин). Теплый твердой питательной ½ MS, налить его в поле культуры стерильный завод на высоте 2 см и дайте ему остыть до затвердевания. Деликатно место каждое семя на твердой питательной, используя стерильный пинцет. Закройте окно стерильные. Передать поле рост палата при 22 ° C с фотопериода 16 h/8 h день/ночь и льна проращивания на 2 недели. 2. метаболические включение химических репортеров Примечание: Ниже представлены три экспериментальные модели: i) метаболических Маркировка сечения ствола, ii) весь стебли и саженцев iii) завод. Каждый протокол представлен один из биологических репликации и количествах может быть адаптирована к количество необходимых биологических реплицирует. Monolignol решения готовятся из запасов решений, которые сделаны, как описано в таблице 2 до эксперимента. Складе решения могут храниться несколько месяцев при температуре-20 ° C. HAZ: GALK или H:G пропорции можно подогнать все заказные экспериментальные проекты. Включение химических репортер в 2 сечения месяц старый льна стволовых Подготовьте 300 мкл химических репортер раствор, содержащий GALK 10 мкм и 10 мкм HAZ в жидкой среде стерильные ½ MS. Вихревой HAZ/GALK решение и передача его в одной скважиной 48-ну плиты с микропипеткой. Подготовьте 300 мкл отрицательный контроль решение, содержащее G 10 мкм и 10 мкм в жидкой среде стерильные ½ MS ч . Вихревой H/Г раствор и перенести его на второй хорошо же 48-ну пластины. Вырежьте стебель льна завода 2 месяцев на 10 см выше уровня почвы, с помощью нового лезвия бритвы. Деликатно Подготовьте 50 freehand поперечного сечения ствола с помощью лезвия бритвы (приблизительно 150-250 мкм толщиной). Сразу же место сечений в жидкой среде стерильные ½ MS в часы стекло. Осмотрите и выберите нетронутыми всего сечения и случайным образом распределить 10 из них в хорошо заполнены с HAZ/GALK решения. Повторите шаг 2.1.8 для хорошо заполнены с H/G решение (как отрицательный контроль). Повторите шаг 2.1.8 для третьего хорошо заполнены с 300 мкл ½ MS среды (как фон управления для настройки базовых флуоресценции при последующей обработке данных confocal микроскопии изображений). Инкубируйте пластины в непрерывный свет в камере роста при 20 ° C для 20 h. Удалите monolignol решение в каждой скважине с микропипеткой. 500 мкл ½ MS среднего для каждой скважины, перемешать аккуратно за 10 мин и удалить это полоскания раствор с микропипеткой. Повторить 4 раза и приступить к БЛАЖЕНСТВУ маркировки сразу (раздел 3). Включение химических репортер в 2 месяца старый льна всего стебли Приготовляют раствор химических репортер 5 мл, содержащие GALK 10 мкм и 10 мкм HAZ в жидкой среде стерильные ½ MS. Вихревой HAZ/GALK решения и передачи его в 20-см высотой стекла тест трубки с пипеткой. Подготовьте 5 мл отрицательный контроль решение, содержащее G 10 мкм и 10 мкм в жидкой среде стерильные ½ MS ч . Вихревой H/G решение и передачи его в 20-см высотой стекла тест трубки. Подготовка третьего стекла пробирки, содержащие 5 мл среды ½ MS (как фон управления для настройки базовых флуоресценции при последующей обработке данных confocal микроскопии изображений). Вырежьте стебель льна завода 2 месяцев на 10 см выше уровня почвы, с помощью нового лезвия бритвы. Отказаться от корневой системы и Нижняя часть ствола и переходите к следующему шагу с верхней частью стебель. Погружать основание всего Вырежьте стебель в пробирку, содержащую HAZ/GALK решения. Место ствола в инкубации решения сразу же после удаления корневой системы для того, чтобы предотвратить его от высыхания.Примечание: Если метод применяется к младшим/старых растений и/или других видов, объем monolignol решения должны корректироваться в соответствии с размером / возраст завода и диаметр его ствола. Прикрепите ствола к вертикальной опоре держать его прямо. Уплотнение стеклянную трубку с парафина, чтобы избежать испарения раствора. Повторите шаги 2.2.6-2.2.9 для отрицательного контроля образца с H/Г раствор. Повторите шаги 2.2.6-2.2.9 для образца управления фон флуоресценции, содержащие ½ MS среднего. Инкубируйте каждого ствола для 20 h в непрерывный свет с помощью неоновый свет. После 20 h метаболических инкорпорации, удалить стволовых, инкубировали в HAZ/GALK решения и промойте его с ½ MS среднего. Вырезать и отказаться от нижней 1 см ствола с помощью лезвия бритвы и затем подготовить цилиндром высокой 1 см от основания ствола оставшихся. Тщательно подготовить 20 freehand поперечного сечения (приблизительно 150-250 мкм толщиной) от этого цилиндра и поместите их непосредственно в стакане часы, заполнены с ½ MS среднего. Положите 500 мкл ½ MS среды в одной скважине 48-ну плиты. Осмотрите выберите нетронутыми всего сечения и случайным образом распределить 10 из них в хорошо заполнены раствором ½ MS. Повторите шаги 2.2.13-2.2.17 для отрицательного контроля стволовых, инкубировали с H/Г раствор. Повторите шаги 2.2.13-2.2.17 для флуоресценции фон управления стволовых инкубировали с ½ MS среднего. Осторожно удалите решение в каждой скважине с микропипеткой. 500 мкл ½ MS среднего для каждой скважины, перемешать аккуратно за 10 мин и удалить это полоскания раствор с микропипеткой. Повторить 4 раза и приступить к БЛАЖЕНСТВУ маркировки сразу (раздел 3). Включение химических репортер в 2 недели старый льна саженцевПримечание: Следующие шаги все осуществляется в стерильных условиях. Приготовляют раствор химических репортер 2 мл, содержащие GALK 10 мкм и 10 мкм HAZ в жидкой среде стерильные ½ MS. Вихревой HAZ/GALK решения и передачи его в 20 см высотой стекла тест трубки с пипеткой. Подготовьте раствор отрицательный контроль 2 мл, содержащий G 10 мкм и 10 мкм H в жидкой среде стерильные ½ MS. Вихревой H/G решение и передачи его в 20 см высотой стекла тест трубки. Подготовка третьего стекла 20-см высотой пробирки, содержащие 2 мл среды ½ MS (как фон управления для настройки базовых флуоресценции при последующей обработке данных confocal микроскопии изображений). Деликатно удалить 2-недельных льна рассады из твердой питательной ½ MS, используя пару длинный пинцет (раздел 1.2. выше). Аккуратно перенести саженец в пробирку, содержащую HAZ/GALK решения, обеспечивая, что ее корни погружены в решении. Закройте стеклянную трубку с пластиковой крышкой, чтобы избежать испарения. Повторите шаги 2.3.6-2.3.8 для отрицательного контроля труб с H / Г раствор. Повторите шаги 2.3.6-2.3.8 для флуоресценции фон управления трубка, содержащая ½ MS среднего. Инкубировать каждый саженец в непрерывный свет в камере роста для 20 ч при 20 ° C. Деликатно удалить Рассада, инкубировали в HAZ/GALK решения и промойте его с ½ MS среднего. Деликатно Подготовьте 20 freehand сечения (приблизительно 150-250 мкм толщиной) гипокотиля. Положите 500 мкл ½ MS среды в одной скважине 48-ну плиты. Осмотрите выберите нетронутыми всего сечения и случайным образом распределить 10 из них в хорошо заполнены раствором ½ MS. Повторите шаги 2.3.12-2.3.15 для рассады отрицательный контроль, инкубировали с H/Г раствор. Повторите шаги 2.3.12-2.3.15 для флуоресценции фон управления Рассада инкубировали с ½ MS среднего. Осторожно удалите решение в каждой скважине с микропипеткой. 500 мкл ½ MS среднего для каждой скважины, перемешать аккуратно за 10 мин и удалить это полоскания раствор с микропипеткой. Повторить 4 раза и приступить к БЛАЖЕНСТВУ маркировки сразу (раздел 3). 3. двойной флуоресценции маркировки поперечных образцов растений, SPAAC и CuAAC Примечание: БЛАЖЕНСТВО, маркировки протокол идентичен для всех 3 экспериментальных моделей (раздел 2). Штамм способствует маркировки азид-алкины циклоприсоединения (SPAAC) Подготовка 1 мл SPAAC раствора, содержащего 5 мкм DBCO-PEG4-5/6-carboxyrhodamine 110 в жидкой среде стерильные ½ MS. Вихревой решение и держать его в темноте. После окончательной стирки шаги метаболических включения протокола [2.1.13 2.2.21 или 2.3.19 в зависимости от выбранной экспериментальный дизайн], удалите средство ½ MS и 300 мкл раствора SPAAC на хорошо с микропипеткой. Щит 48-ну пластины от света покрытия алюминиевой фольгой или путем размещения его в коробку. Аккуратно перемешайте пластину на механических шейкер для 1 h в темноте при температуре окружающего воздуха. Медь катализируемого маркировки азид-алкины циклоприсоединения (CuAAC) Мыть каждый хорошо 4 раза как описано в шаге 2.1.13 при сохранении пластину в темноте. Подготовка 1 мл CuAAC раствора, содержащего Аскорбат натрия 2,5 мм, 0,5 мм CuSO4 и 5 мкм35-ТАМРА-PEG-азид в жидкой среде стерильные ½ MS. Вихревой решение и держать его в темноте.Примечание: Это CuAAC решение должно быть свежеприготовленные до использования и не может храниться более чем на несколько дней при 4 ° C. Удалите средство ½ MS в каждой скважине и непосредственно 300 мкл раствора CuAAC на хорошо с помощью микропипеткой. Аккуратно перемешайте пластину на механических шейкер для 1 h в темноте при температуре окружающего воздуха. Удаление с помощью микропипеткой решения CuAAC. С помощью микропипеткой, 500 мкл ½ MS, перемешать в темноте за 10 мин затем удалить это моющий раствор. Повторите дважды. 500 мкл раствора метанола и воды 7:3, перемешать в темноте за 1 ч, а затем удалить решениеПредупреждение: Метанол токсичных контакта с кожей или вдыхания и обозначается как канцероген человека. Его использование требует химических вытяжных и перчатки. 500 мкл ½ MS, перемешать в темноте за 10 мин, затем удалить решение. Повторите 4 раза. 4. Монтаж образцов на Микроскоп слайды Место 5 капли среднего монтажа на стекло микроскопа. Тщательно пополнить каждый часAZ/GALKметкой сечение на слайде. Примените лак на двух противоположных боковых сторонах слайда. Обложка слайд с coverslip. Будьте осторожны избежать воздушных пузырей. Удалите излишки монтажной среды с помощью бумажным полотенцем. Печать образца с лак на всех 4 сторон. Пусть ногтей лаком сухой при комнатной температуре (около 30 мин). Повторите шаги 4.1-4.6 для сечений H/G отрицательного контроля. Повторите шаги 4.1-4.6 для флуоресценции сечений фон элемента управления. Храните слайды при температуре 4 ° C в темноте до наблюдения под конфокального микроскопа.Примечание: Подготовленные слайды могут храниться в течение нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от качества подготовки. Если новое наблюдение должно быть сделано после хранения, убедитесь, что образцы не пересохли. 5. изображения приобретение конфокальной микроскопии флуоресцирования Включите все необходимые единицы confocal микроскопии системы в правильном порядке в соответствии с инструкциями производителя. Выберите желаемой цели с максимальной числовая апертура и адаптированы волны возбуждения и выбросов (например, obj. 60 x, н.а. 1.2. Аутофлюоресценция канал: λex 405 нм, λет 450 Нм /25; SPAAC HAZ канал: λex 488 нм, λет 525 /25; CuAAC GALK канал: λex 561 Нм, λет 595 Нм /25; Последовательный режим). Выберите нужные параметры для генерации изображений в программном обеспечении (12 или 16-бит требуется, размер пикселя, адаптированных к критерий Найквиста). Место/g HAZALK слайд на микроскопа и положение образца под объектив. Наблюдать и найти желаемый регион растительной ткани. Получить высокое качество конфокальный изображения вдвойне помечены HAZ/gALK образца. Выберите наиболее флуоресцентные плоскости в оси z. Отрегулируйте усиление, смещение и лазерной энергии для достижения оптимального сигнала распределения вдоль всей серый уровня диапазона для каждого канала (аутофлюоресценция, AZ H и GALK). Те же параметры должны применяться для всех следующих приобретений. Запуск на приобретение выбранного изображения и сохраните файл. Повторите для каждой соответствующей области образца.Примечание: при необходимости также может быть приобретено 3D реконструкций Z-стека. Используя те же параметры, получать изображения непомеченным образца только инкубировали в ½ мс для определения уровня аутофлюоресценция (флуоресценции фон управления, как описано в разделе 2). Используя те же параметры, получать изображения для отрицательных контрольных образцов, инкубировали с родной монолигнолов H/G для определения адгезии неспецифические Флюорофор образца. Применение обработки данных на приобретенные изображения вычитать фон аутофлюоресценция сигналы в отрицательный контроль изображения H/G и HAZ/gALK изображения.

Representative Results

С использованием представленные БЛИСС протокола, связанных с синтетическими monolignol аналогов и bioorthogonal нажмите химии, это позволяет визуализировать динамику процесса lignification в живых растений. В отличие от установленных методов лигнина визуализация (например, гистохимические пятнать, immunolocalization или аутофлюоресценция), это «дважды щелкните» Протокол исключительно цели лигнина производится de novo в ходе метаболических инкорпорации шаг и отличает его от ранее существовавшие лигнина образца с сотовой изображений трехканальный, конфокальная флуоресцентной микроскопии (рис. 3). H AZ-единицы выявляются с помощью возбуждения и выбросах волн DBCO-PEG4-5/6-carboxyrhodamine 110, специально нажал на азид функции включены HAZ молекул на этапе SPAAC (λex 501 Нм /λет 526 Нм, зеленый канал), тогда как GALK-единицы также обнаруживаются на характерные длин волн azidefluor 545 зонд, который специально нажал на встроенный терминал алкины теги G ALK на этапе CuAAC (λex 546 Нм /λет 565 Нм, красный канал); Третий канал соответствует ранее существовавших лигнин, который обнаруживается с помощью встроенных аутофлюоресценция в 405 нм (синий канал). Этот подход приводит к генерации карты трехцветные локализации лигнина в стенах клетки растений, которые обеспечивают точную пространственной информации о присутствии или отсутствии активных lignification механизма между различных тканей органа (рис. 3A ), между различных типов клеток в пределах же ткани (рис. 3B-C) и слои различных стены же ячейки (рис. 3D). Другими словами эта методика позволяет нам выделить и конкретно локализовать сайты «активных» lignification (HAZ и GALK каналы), отличающую их от зон, где лигнина был сформирован на ранней стадии развития растений (аутофлюоресценция канал). Кроме того, чувствительность метода резко усиливается, когда по сравнению с аутофлюоресценция, и гораздо меньшие суммы недавно синтезированных лигнина может быть обнаружен (рис. 3B). Рисунок 3: Imaging включены monolignol химических репортеров в стеблях льна. (A) половина ручной поперечном разрезе ствола льна, реконструированный картины. (B) крупным планом первой слоев дифференциации ксилемы. Левая панель: аутофлюоресценция лигнина (синий, 405 нм), Средняя группа: объединены аутофлюоресценция лигнина (синий) и HAZ флуоресценции (зеленый, 526 Нм) каналы, правой панели: объединены аутофлюоресценция лигнина (синий) и GALK флуоресцирования (красный, 565 Нм) каналы. Стрелка указывает первый помечены клеточной стенки из Камбия, иллюстрирующие повышенная чувствительность по сравнению с аутофлюоресценция блаженства. (C) обозначать в другую ячейку, которую типы вторичных ксилема и (D) заделывают на вторичные ксилема клетки, иллюстрирующие маркировки вариации в разных слоях же клеточной стенки. Левая панель: слияние аутофлюоресценция лигнина (синий) и HAZ флуоресценции (зеленый, 526 Нм) каналы, Средняя группа: объединены аутофлюоресценция лигнина (синий) и GALK флуоресценции (красный, 565 Нм) каналы, право Группа: слияние аутофлюоресценция лигнина (синий), HAZ (зеленый) и GALK (красный) каналы флуоресценции. HAZ и GALK Сопредседатель локализации изображен желтый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Химические репортер стратегии как метод БЛАЖЕНСТВО, представленные здесь или маркировки одной процедуры, ранее опубликованные Tobimatsu et al. 8 поэтому позволяют гораздо тоньше исследование, чем ранее доступные методы, такие как иммуно – или гистохимические окрашивание в то же время очень прост в реализации. Например, Рисунок 4 иллюстрирует, что интенсивность сигнала для HAZ/GALK включения в волокна tracheids/судов (FT) льна вторичных ксилемы очень высок в первые несколько клеточных стенок из Камбия, но в старых клеток постепенно уменьшается. Этот профиль противоположно аутофлюоресценция и указывает, что максимальная lignification очень быстро достигнут в первых двух-трех футов слои клеток из камбия. В противоположность этому, Рэй (R) клетки появляются продолжать lignification к гораздо более поздних стадиях их развития как HAZ/GALK включение гораздо более постоянна в стенах всех клеток из камбия сердцевина. Это не удивительно, что типы клеток FT и R отображения противопоставляется lignification динамику, так как эти типы клеток имеют различные биологические функции с связанных различия в их программы развития. ФНС действительно удлиненные трубы, которые пожилые и умирают быстро, оставив мертвый пустые ячейки с толстыми Стачивание стенами, которые играют существенную роль в механическую поддержку и вертикального транспорта воды и минералов, тогда как узкими рядами R клетки, которые составляют ксилемы лучи живы в их пожилые и функциональное состояние не имея толстые Стачивание стены. Рисунок 4: клеток конкретных monolignol репортер включение в лен ксилемы. Брайт поле confocal микроскопии вид (A) частью руки сечением от стебля льна. Розовый (Рэй паренхиме клеток, R) и желтый (волокно Трахеиды клетки, FT) стрелки показывают, векторные, охватывающих от камбиальных зоны к сердцевина и просмотрены для аутофлюоресценция лигнина в 405 нм (B), HAZ флуоресценции в 526 Нм (C) и G ALK флуоресценции в 565 Нм (D). (E) представление вторичного ксилемы. Левая панель: слияние лигнина аутофлюоресценция (синий), HAZ (зеленый) и GALK флуоресцирования (красный) каналы. HAZ и GALK Сопредседатель локализации изображен желтый. Правая панель: схематическая иллюстрация вторичных ксилема структуры в стволе льна. V, судно; FT, волокна Трахеиды; R, Рэй паренхиме клеток. Эта цифра была изменена от Льва и др. 23 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Кроме того использование двух различных химических репортеров, соответствующий для H – и G-единиц с двумя bioorthogonal реакции в протоколе БЛИСС позволяет больше количественных результатов, которые могут быть получены. Мультиплексированных маркировки стратегии, такие как БЛИСС может обеспечить дополнительные идеи о контроле за monolignol включение показателей в различных условиях и могло бы способствовать расшифровка неуловимый lignification процесса. Если относительная доля H, G и S монолигнолов в лигнин действительно очень перемеююый согласно видов, ткани, возраст или экологических условий завода, сложных механизмов, которые регулируют этот состав понимаются все еще не полностью. Двойная маркировка технология представляет собой мощный способ расследования некоторых из параметров, которые регулируют состав лигнина. Например, различные HAZ: GсоотношениеALK блаженством позволили нам продемонстрировать, что состав лигнина в тканях среднего ксилема напрямую зависит от наличия monolignol в пределах стены клетки, а не на Специфика пероксидазы/лакказой (рис. 5). Рисунок 5: Эффект инкубации льна стволовых секции с различных процентных соотношенийаз H и GALK. HAZ: GALK% коэффициенты даны над каждым столбцом фигур. Вверху: слияние HAZ и GALK каналы. Внизу: гистограммы, указывающее интенсивность средняя флуоресценции HAZ иALK G для соотношения различных %. Значения выражаются в виде средней интенсивности среднее флуоресценции в ± SD. шкала уровней серого бар = 100 мкм. эта цифра была изменена от льва и др. 23 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Лен выращивается для его лубяных волокон (BF), которые используются для производства текстиля, роскошь документы или экологически чистых композитных материалов. Важным аспектом их промышленного индексации является, что они содержат очень низкие уровни лигнина в их клеточных стенок, которые характеризуются чрезвычайно толщиной19,S2/G среднего слоя24. БЛИСС можно выделить lignification динамика различия между разными слоями же клеточной стенки. Рисунок 6A показывает, что HAZ и GALK репортер включения ограничиваются клетки углы и середине ламеллы/основной клеточной стенки некоторых, но не все лубяных волокон. Полное отсутствие lignification в слое стены толстые мочинец среднюю клетки даже тогда, когда monolignol химических Репортеры экзогенно поставляется показывает, что их состояние hypolignified возникает из-за отсутствия молекулярной среды подходит для ферментативно опосредованной окисления и включение монолигнолов в растущей цепи полимера, и что это не просто из-за регуляцию генов биосинтеза monolignol как ранее сообщила25. Это замечание также хорошо коррелирует с тем что льна пероксидазы, что гены вверх регулируются в тканях внешней стебель льна химических lbf1 мутант, который обладает Стачивание лубяных волокон26. Рисунок 6: БЛАЖЕНСТВО освещаются различия конкретных каркаса или слоя клеточной стенки. Левая панель (A): изображение ярко поля льна стволовых секции. Круг указывает локально тривиальное расслоение. Правая панель: крупным планом на лубяных волокон. Объединены HAZ и GALK каналов (с и без ярко поле) показаны, что lignification ограничена углами клеток () и середине ламеллы/основной клеточной стенки некоторых лубяных волокон. BF, лубяные волокна; Пар, паренхиме клеток; M, в середине ламеллы; P, основной клеточной стенки; S1, первый слой вторичных клеточной стенки; S2/G, среднего слоя/желатиновой слой вторичных клеточной стенки. (B) 2D срез и 3D-реконструкции Конфокальный z стека зум льна корень эндодермы региона. Каспари () только отображает аутофлюоресценция и не включаютAZ H или GALK. Связанные fluorogram показываетALKG/hAZ анти корреляции: высокой зеленой флуоресценцией ассоциируется с низким красный сигнал (кора) и наоборот (эндодермы). Pericycle (P), эндодермы (E), Cortex (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Наконец эта методология-двухцветный также может предоставить ценную информацию о состоянии «lignification» клеточной стенки подструктур на различных этапах своего развития и в органах растений отличных от ствола. Например эндодермы льна корни характеризуется наличием Casparian группы в своих радиальных и поперечных стенках ячейки на ранних стадиях развития. Эта группа гидрофобные биополимер, сделанные из суберин или лигнина, предотвращает воды и растворенных веществ, принятые корень пассивно въезжать через апопласт и заставляет их пройти через плазматическую мембрану по symplastic маршруту, тем самым способствуя селективного поглощения мощности корней растений. При применении к корням льна, наша стратегия показал, что HAZ и GALK включены в касательной стенках эндодермы клеток, а также в части радиальных стен где Casparian группа отсутствует (Рисунок 6B). Однако полное отсутствие monolignol репортер инкорпорации в полосе Casparian сам указывает, что это пожилые на этой стадии развития в то время как другие стены по-прежнему являются сайт далее биополимера осаждения. Реконструированный 3D вид z-стека четко выявляет Casparian группы. Интересно, что стены некоторых корковых клеток, прилегающих к эндодермы также оказались способны включения HAZ преференциально (таким образом, указывающих на наличие лигнина/суберин в лен корневой коры) но не GALK. Совместное локализации анализ показал анти корреляции между HAZ и GALK, которые предполагают существование стены клетки специфические структуры/ферментативные механизма в этих двух типов соседних клеток. Справочная таблица 1: подготовка твердых ½ MS среднего Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Справочная таблица 2: подготовка запасов растворов химических репортер Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Как упоминалось ранее двойной маркировки БЛИСС протокол, представленных в настоящем документе является одним из первых примеров SPAAC/CuAAC комбинации в vivo¹²^,²³. Каждый шаг был тщательно оптимизированы и проверены, и это очень важно, что порядок, в котором два нажмите химии, обозначая реакции выполняются последовательно соблюдается (то есть, SPAAC сначала, а затем CuAAC). Все кросс контроль показал, что каждый обозначая шаг конкретных когда БЛИСС протокол прикладного²³ : сначала проведение SPAAC шаг приводит к весьма chemoselective маркировки H_AZ азид функций cyclooctyne функционализированных Флюорофор через [3 + 2]-циклоприсоединения реакции с быстрым кинетики. Как только помеченные единицы H_AZ , CuAAC шаг, требуя copper(I) катализировано Активация G_ALK терминала алкинам для создания триазола ссылки по реакции с 545 зонд азид Фтор может осуществляться. В отличие от, в обратном порядке (то есть, CuAAC сначала, а затем SPAAC) не должны использоваться как это приводит к блоку_ALK Gи H_AZ кросс муфта, которая конкурирует с Флюорофор перевязка и вызывает резкое потери сигнала . Важно также подчеркнуть необходимость промежуточных Стиральная шаги во избежание неспецифичный пятнать.

Мы показали, что наш метод может применяться для различных конструкций биологический эксперимент. БЛИСС, маркировки протокол был впервые применен в руки сечения льна стебли (приблизительно 150-250 мкм толщиной), которые были ранее вырезать и инкубировали с монолигнолов нажмите кнопку Готово. Хотя эта конструкция имеет преимущество минимизации необходимых количеств химических репортер (как сокращаются объемы инкубации) и облегчения производства статистической реплицирует, это не, строго говоря, система в естественных условиях и в некоторых случаях, могут не отражать все аспекты динамики реальных пространственно временных lignification. Второй экспериментальный дизайн мы поэтому адаптирована БЛИСС протокол к методу, который ранее использовался для изучения включение radiolabeled монолигнолов в сосновых и гинкго²⁷. В этом подходе корни и стебель растения физически отделены и основания весь стебель инкубировали в monolignol растворе в то, что может дублироваться «цветок ваза» подход. После ухода из стеблей время желаемого (инкубации), сечения являются вырезать и БЛАЖЕНСТВО протокол выполняется. Это позволило нам показать (i) что модифицированных монолигнолов транспортируются через ствол жизни и включены в растущих лигнина полимеров в пределах стены клетки и (ii) что шаблон локализации был по существу идентична поперечного сечения подход. Этот тип эксперимент имеет заслуги в реальной жизни растений / живой клетки подход, позволяя больше экспериментов и более углубленные исследования, но требует большего количества химических репортер. Наконец протокол БЛАЖЕНСТВО также использовался с лен завод саженцев, представляющие реальной жизни модель завода, в котором химическая репортеры должны быть всасывается через корни до транспортируется вверх ствола. Хотя эта модель имеет явное преимущество в живых растений, на практике, он ограничивается молодых саженцев и не совсем подходит для изучения lignification динамики в старых растений по практическим соображениям (длительный инкубационный время, повышенные количество химических репортеров). Тем не менее эти три эксперимента конструкции являются взаимодополняющими, и все имеют свои плюсы и минусы относительно практических аспектов и биологическое значение в зависимости от типа биологических вопрос ответа.

Разработан для изучения lignification динамики в лен, наш протокол является очень гибкой, не только с точки зрения биологических эксперимента, но и с точки зрения его применения в других растительных видов и органов/тканей. Например может легко передаваться БЛИСС Arabidopsis или тополь родов, которые поддаются более исследования с нокаут- или НОК Даун мутантов для различных генов. В принципе двойной маркировки исследования с нашим подходом также могут быть расширены для других биомолекул с помощью двух различных модифицированных прекурсоров клеточной стенки растительных полимеров – включая все три главных монолигнолов или их метаболические прекурсоров а также различные моносахариды, которые составляют полисахаридной матрице. С момента своего создания bioorthogonal химии действительно главным образом разработана расследовать гликанов/полисахариды через метаболические олигосахарида инженерных (МО)⁴^,⁵^,¹⁷^,²⁸, но удивительно там были только очень немногие приложения к заводе биологии пока⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,^,¹¹¹². С точки зрения совместимости реакций исследование лигнина был действительно сложное дело решить как оба химических Репортеры включены в один и тот же сетчатые полимер. Возможность немеченого H_аз–G_ALK перекрестных ссылок формирования была основным вопросом преодолеть благодаря пространственной близости G_ALK и H_AZ подразделений в 3D Структура лигнина²³, ограничения, которые не могут присутствовать, если два химических репортеры не включены в тот же тип биополимера или в регионе же пространственных любой заданной ячейки.

В более широком масштабе БЛИСС методологии по существу может применяться к любой исследования изображений-двухцветный флуоресценции в бактериальной или животных моделях, с использованием двух различных химических репортеров, принимая азид и терминала алкины тег, соответственно.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы в долгу перед FRABio Федерации научно-исследовательских и TisBio изображений платформы (Univ. Лилль, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Biomoléculaires Fonctionnelle des ассамбляжи) для предоставления технических условий, благоприятных для достижения этой цели работа.

Materials

(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (H_AZ)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (G_ALK)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% sodium hypochlorite
20 cm high glass tube
250 mL Schott glass bottle
48-well Plate
5/6-TAMRA-PEG₃-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
Aluminium foil
Cheese cloth
Compost containing clay
Coniferyl alcohol (G)	Sigma Aldrich	MFCD00002922
Copper (II) sulfate pentahydrate
DBCO-PEG₄-5/6-Carboxyrhodamine 110	Jena Bioscience	CLK-A127-1
Milli-Q Ultrapure water
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Flax seeds (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Glass coverslip
Glass microscope slide
Growth chamber	CLF-Plant Climatics		For 2-week-old plants culture
Growth chamber	Angelantoni Life Sciences		For 2-month-old plants culture
Magenta plant culture box			For 2-week-old seedling culture
Methanol			Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood
Micropipette
Nail polish
Nikon A1R confocal microscope	Nikon
Orbital shaker
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)	Carbosynth	FC145653
Plastic cap
Plastic pipette
Plastic pot			For 2-month-old plants culture
Razor blade
Rubber band
Sodium Ascorbate
Sterile clamp
Vertical support
Vortex
Reagents for liquid and solid ½ MS medium
KH₂PO₄
KNO₃
NH₄NO₃
MgSO₄.7H₂O
CaCl₂.2H₂O
MnSO₄.H₂O
ZnSO₄.7H₂O
H₃BO₃
KI
Na₂MoO₄.2H₂O
CuSO₄.5H₂O
CoCl₂.6H₂O
Na₂EDTA.2H₂O
FeSO₄.7H₂O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Glycine
Nicotinic acid
Myo-inositol
Saccharose
MES hydrate
Agar

Referencias

Grammel, M., Hang, H. C. Chemical reporters for biological discovery. Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).
Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. Chemistry in living systems. Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).
Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).
Chang, P. V., et al. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).
Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
Mbua, N. E., et al. Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).
Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).
Tobimatsu, Y., et al. A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification. Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).
Bukowski, N., et al. Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls. Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).
Pandey, J. L., et al. A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls. PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).
Pandey, J. L., et al. Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems. Front Plant Sci. 7, (2016).
Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).
Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).
Weng, J. -. K., Chapple, C. The origin and evolution of lignin biosynthesis. New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).
Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification. Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).
Rinaldi, R., et al. Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis. Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).
Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).
Feng, L., et al. Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans. J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).
Dumont, M., et al. Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d – manno -oct-2-ulosonic acid. Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).
Niederwieser, A., et al. Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry. Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).
Späte, A. -. K., et al. Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering. Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).
Späte, A. -. K., et al. Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter. Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).
Lion, C., et al. BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants. Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).
del Río, J. C., et al. Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives. J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).
Huis, R., et al. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems. Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).
Chantreau, M., et al. Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition. The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).
Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora. Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).
Noel, M., et al. Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human β-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins. Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Simon, C., Spriet, C., Hawkins, S., Lion, C. Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!. J. Vis. Exp. (131), e56947, doi:10.3791/56947 (2018).