Cerebral organoids representerer en ny modellsystem å undersøke tidlig menneskelige hjerne utviklingen i vitro. Denne artikkelen gir detaljert metoder for å effektivt generere homogen rygg forebrain-type organoids fra menneskelige indusert pluripotent stamceller inkludert avgjørende karakterisering og godkjenningen skritt.
Menneskelige cortex utvides svært og viser en kompleks struktur med funksjonelle områder, gir høyere hjernefunksjon, som erkjennelse. Innsats for å studere menneskelige hjerne cortex utvikling har vært begrenset av tilgjengeligheten av modellsystemer. Oversette resultatene fra gnager studier til mennesket er begrenset av arter forskjeller og studier av menneskelig primære vev er hemmet av mangelen på vev tilgjengelighet samt visse etiske spørsmål. Siste utviklingen i menneskelig pluripotent stamceller (PSC) teknologi omfatter generering av tredimensjonale (3D) selv-organisering organotypic kultur systemer, som etterligner til en viss grad menneske-spesifikke hjernen utvikling i vitro. Foreløpig er forskjellige protokoller tilgjengelig for generering av hele hjernen eller hjernen-regionen bestemte organoids. Metoden for homogen og reproduserbar forebrain-type organoids fra indusert PSC (iPSC), som vi tidligere etablert og beskrive her, kombinerer iboende evne til PSC selv ordne med guidete differensiering mot den fremre neuroectodermal avstamning og matrix innebygging for å støtte dannelsen av en kontinuerlig neuroepithelium. Mer spesifikt, denne protokollen innebærer: (1) generasjonen av iPSC aggregat, inkludert konvertering av iPSC koloniene til en confluent monolayer kultur; (2) induksjon av fremre neuroectoderm; (3) innebygging av neuroectodermal aggregater i en matrise stillaset; (4) generasjonen av forebrain-type organoids fra neuroectodermal aggregater; og (5) fiksering og validering av forebrain-type organoids. Slik gir denne protokollen en lett anvendelig system for generering av standardiserte og reproduserbar iPSC-avledet kortikale vev strukturer i vitro.
Den menneskelige hjernen er klart en av de mest komplekse organene og er ansvarlig for alle menneskelige intellektuelle evner. Dermed er en dypere forståelse av menneske-spesifikke hjernens utvikling en viktig forutsetning for forståelsen av menneskelige kognitive evner. Tradisjonelt transgene dyr var modell organismer å studere hjernens utvikling. Disse modellene gitt grunnleggende innsikt i prinsippene i hjernens utvikling. Vi vet nå at en vanlig funksjon i hjernens utvikling i alle pattedyr er en presis koreografi stamfar spredning, neurogenesis og neuronal migrasjon. Det er imidlertid betydelige strukturelle forskjeller mellom hjernen til modell organismer, som gnagere og mennesker, spesielt i neocortex. De primære mekanismene som har blitt foreslått å bidra til primas kortikale evolusjon er en økt spredning av stammen og stamfar celler og generering av ytre radial glia celler (oRGCs), som er bare svært sjelden funnet i Red1 ,2,3.
Metodene til modell menneskelige hjerne cortex utvikling omfatter generering av PSC-avledet telencephalic stamfar celler og hjernebarken projeksjon neurons som monolayer kulturer. Dette standardiserte differensiering protokoller spille visse aspekter av menneskelig kortikale utvikling som stereotypiske timelige rekkefølgen på kortikale neurogenesis4. De, men faller kort når det gjelder recapitulation av utviklingsprosesser av organogenesen som romlige mønstre og morphogenesis. Nyere utviklingen i stem cell biology førte til etableringen av 3D organoid kulturer fra PSCer, som er revolusjonerer forskning i vitro menneskelige organogenesen. Utnytte kapasiteten til PSCer selv ordne i organotypic strukturer, er ulike organoids, som reflekterer strukturelle og funksjonelle egenskaper organer inkludert de av nyre, gut, øyet og hjernen etablert5. Slike organoids inneholder flere organ-spesifikke mobilnettet subtyper, som grupperer og romlig organisere ligner til utvikling organer i vivo5,6. I tillegg avslørt celle komposisjon, avstamning forhold og genet nettverk studier med encellede RNA sekvensering at menneskelige hjerne organoids trofast recapitulate viktige aspekter av menneskelig føtal neocortex utvikling som gene expression programmer 7 , 8. en stor ulempe, noe som forhindret bred programmet så langt, var imidlertid de store parti til parti variasjoner og organoid-til-organoid heterogenitet9.
Her gir vi en detaljert protokoll for en enkel og standardisert forebrain-type organoid kultur-systemet. Det sentrale trekk ved dette systemet er at den effektivt og reproduserbar genererer PSC-avledet organoids nesten eksklusivt dorsal telencephalic identitet. Protokollen er basert på metoder som brukes i våre siste Celle rapporter papir10. Det kombinerer Self-Organization kapasiteten for iPSCs med selektiv induksjon av kortikale neuroepithelium og robust kan generere homogene kulturer av tidlig dorsal telencephalic vev innen 3 uker. Protokollen bygger på tidligere rapporterte SMAD signalering og Wnt hemming strategi som guider differensiering av PSC mot den fremre neuroectodermal avstamning11,12 i kombinasjon med matrix embedding, som fremmer dannelsen av store og kontinuerlig neuroepithelial strukturer13. Vi har brukt metoden beskrevet på ulike iPSC linjer, med flere kloner per person. Vi viste at dette systemet er egnet for nedstrøms applikasjoner der reproduserbarhet og homogenitet er av stor betydning som sykdom modellering. Når protokollen gjelder iPSCs avledet fra pasienter som lider av en alvorlig kortikale malformation, var vi recapitulate patologisk kjennetegnene av sykdom i vitro og identifisere nye molekylære mekanismer som fører til den fenotypiske endrer10. Vi foreslår at beskrevet organoid protokollen kan benyttes for å lukke gapet mellom reduksjonistiske PSC-avledet kortikale monolayer kulturer og i vivo studier, og at det representerer en pålitelig og stabil cellen-basert modell-system for å simulere tidlig menneskelig kortikale utvikling i helse og sykdom utenfor menneskekroppen.
Hjernen organoids representerer et kraftig verktøy for å studere menneskelige hjerne utviklingen i vitro som de gir aktuelle arten bakgrunnen og komplekse 3D arrangementet i celler i en vev sammenheng. Med det bygge de bro mellom ikke-menneskelige dyr modeller og reduksjonistiske menneskelige todimensjonal monolayer celle kultur teknikker. Programmene er imidlertid hemmet av mangel på reproduserbarhet9. Vi har utviklet en forebrain-type organoid-protokollen, som overvinner stor prøve å sample variasjon ved å kombinere den selv-organisering kapasiteten til iPSC med sine amenability til mønster faktorer. Spesielt iPSCs var samlet for å fremme selvstendig organisasjon og senere hemme TGF-ß/SMAD signalering å fremme dorsal cortex differensiering ved å utsette kulturer til BMP (LDN-193189) og en TGF-β type I-reseptor hemmere (A83-01). I tillegg, ble et stoff som hemmer Wnt veien (IWR) for å forhindre posteriorization brukt. I motsetning til “intrinsic” hjerne organoid protokoller19, som baseres på selvstendig montering uten ekstern kontroll gir opphav til heller heterogen hjernen organoids og viser stor variasjoner (målt ved effektiviteten av polarisert nevrale ektoderm formasjon15), protokollen beskrevet her reproduserbar genererer homogen forebrain-spesifikke organoids fra menneskelige iPSCs.
Disse forebrain-type organoids kan brukes til en rekke programmer som neurodevelopmental studier, evolusjonære studier inkludert gen funksjon studier, sykdom modellering og mulig narkotika testing og terapeutiske formål. Protokollen er best egnet til å undersøke tidlig aspekter av menneskelig kortikale utvikling. Vi har for eksempel brukt forebrain-type organoids undersøke menneske-spesifikke deler av vRGC atferd. Mer spesifikt, patofysiologiske filendringer tilknyttet en alvorlig form for lissencephaly, en menneskelig kortikale misdannelse preget av en nærheten fravær av kortikale folding, ble behandlet. Bare visse aspekter av denne sykdommen kan modelleres i mus som musen hjernen er naturlig lissencephalic. Når du bruker organoid systemet på lissencephaly pasient-avledede iPSCs, kunne vi pålitelig recapitulate menneske-spesifikke aspekter av sykdommen og identifisere underliggende mekanismene. Mer spesifikt, kunne vi vise at pasient-avledede organoids viser en betydelig reduksjon i størrelse forårsaket av brytere fra symmetrisk asymmetrisk celledeling av vRGCs. Denne bryteren ble knyttet til endringer i organiseringen av vRGCs’ microtubule nettverk, en forstyrrelse av arkitektur VZ nisje og endret uttrykk for celle vedheft molekyler, fører til svekket aktivering av N-cadherin/β-catenin signalering aksen10. Merke: β-catenin-avhengige regulering av vRGC divisjon moduser ble foreslått for å være menneske-spesifikke som overuttrykte β-catenin i mus fører til tangentiell cortex ekspansjon og senere kortikale folding20. Dermed markere våre data at forebrain-type organoid systemet representerer et lovende verktøy for å studere på en målbar måte human-spesifikke aspekter av tidlig kortikale utvikling i vitro.
En stor utfordring for fremtiden er å opprettholde homogenitet av organoids over lengre tidsperioder for å oppnå mer moden neuronal fenotyper. Dette kan realiseres av ett eller flere av følgende: dyrking organoids i en bioreactor systemet14, bruke flytende stillaser15, supplere differensiering mediet med nevrale vekst eller neuronal overlevelse faktorer. Endelig kan en kontrollert økning i hjernen kompleksitet oppnås ved fusing forebrain-type organoids med cerebral organoids ulike regionale identitet21,22.
Samlet tilbyr forebrain-type organoid protokollen presenteres her en lett anvendelig og pålitelig verktøy for generering av tidlig kortikale strukturer i vitro. Den protokoll gir stige til svært homogen tidlig kortikale vev over flere iPSC linjer og kan brukes til å generere pålitelig person-spesifikke kortikale vev. Dermed er systemet spesielt egnet for programmer som krever en høy grad av homogenitet og reproduserbarhet som sykdom modellering.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av departementet for innovasjon vitenskap og forskning av Nordrhein-Westfalen (Junior Research Group) og av ERA-NET NEVRON, JTC 2015 Neurodevelopmental lidelser, STEM-MCD.
A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
Antibodies | |||
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
N-cadherin | BD | 610921 | |
ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |