والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات
Summary
كما الميتوكوندريا فقط نسبة مئوية صغيرة من الخلايا النباتية، أنها تحتاج إلى أن تنقية لمجموعة من الدراسات. يمكن أن تكون الميتوكوندريا المعزولة من مجموعة متنوعة من أجهزة المصنع بالتجانس، متبوعاً بالطرد المركزي التدرج التفاضلية والكثافة للحصول على كسر المتقدرية تنقية عالية.
Abstract
الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية المعنية في الأيضية العديدة في النباتات، ولا سيما إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من أكسدة المركبات المخفضة مثل نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH) والادنين فلافين dinucleotide (القوات المسلحة الهايتية2). الشرح الكامل لجينوم نبات التمويل قد أنشأ الأكثر استخداماً نظام المصنع النموذجي، وهكذا الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من مجموعة متنوعة من الأجهزة (ورقة أو جذر زهرة) اللازمة للاستفادة الكاملة من الأدوات التي تتوفر الآن لنبات لدراسة البيولوجيا المتقدرية. يتم عزل الميتوكوندريا بتجانس النسيج باستخدام مجموعة متنوعة من النهج، متبوعاً بسلسلة من الخطوات الطرد المركزي التفاضلي المنتجة بيليه المتقدرية النفط خام الذي هو تنقية كذلك استخدام التدرج المستمر كثافة الغروية استخدام الطرد المركزي. بعد ذلك يتم إزالة المواد الغروية الكثافة بخطوات استخدام الطرد المركزي متعددة. ابتداء من 100 غرام أنسجة أوراق جديدة، 2-3 مجم الميتوكوندريا يمكن عادة الحصول على. عرض تجارب الجهاز التنفسي على هذه الميتوكوندريا معدلات نموذجية من 100-250 نمول س2 دقيقة-1 ملغ إجمالي البروتين المتقدرية-1 (NADH-تعتمد على معدل) مع القدرة على استخدام مختلف ركائز ومثبطات لتحديد أي تتأكسد ركائز وقدرة أوكسيداسيس الطرفية الفسفرة وبديلة. ويصف هذا البروتوكول طريقة عزل من الميتوكوندريا من أوراق نبات التمويل باستخدام التدرجات كثافة الغروية المستمر وقياسات الجهاز تنفسي كفاءة الميتوكوندريا محطة تنقية.
Introduction
يعود تاريخ البحوث النباتية الميتوكوندريا على مدى 100 سنة1. في أوائل الخمسينات أولاً عزلة الميتوكوندريا سليمة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. ظهور التدرج كثافة الغروية في الثمانينات سمح الميتوكوندريا تكون تنقيته دون معاناة التكيف ناضح. بينما الميتوكوندريا المنقي التدرج مناسبة لمعظم الأغراض، نظراً لحساسية الكتلي، ملوثات ثانوية نسبيا حتى يمكن اكتشاف وقد يتم تعيين موقع المتقدرية2غير لائق. استخدام التدفق الحر التفريد يمكن إزالة كل بلاستيديك وبيروكسيسومي التلوث3، لكن حرية تدفق التفريد هو تقنية متخصصة للغاية وغير مطلوب للغالبية العظمى من الدراسات. وعلاوة على ذلك، عند تحديد المكان للبروتين يجب أن يكون التذكير بأن جنسية مزدوجة أو متعددة استهداف البروتينات يحدث في الخلايا. يرد ما يزيد على 100 من البروتينات المستهدفة المزدوج للمعايشة/للبلاستيده والميتوكوندريا4، وعدد من البروتينات المستهدفة إلى الميتوكوندريا وبيروكسيسوميس ومن المعروف أيضا5. وعلاوة على ذلك، موقع إعادة البروتينات تحت حوافز محددة، مثل الأكسدة، موضوع ناشئة في بيولوجيا الخلية6. وهكذا، موقع البروتينات يجب أن يؤخذ في سياق درس البيولوجيا، ويتم استخدام مجموعة متنوعة من النهج لتحديد والتحقق من الموقع2.
الميتوكوندريا عادة معزولة من الأنسجة النباتية بالتجانس، وتوازن مطلوب بين كسر جدار الخلية لإطلاق سراح الميتوكوندريا مفتوحة، ولا يضر الميتوكوندريا. تقليديا، التجانس مع البطاطا والقنبيط، ينطوي على استخدام الأجهزة المنزلية خلاط/عصارة جعل استخراج سائل في مخزن مؤقت مع المكونات المختلفة للمحافظة على النشاط. عزل الميتوكوندريا من أوراق البازلاء، (مادة شعبية لعزل المتقدرية استخدام الشتلات الشباب (~ 10 أيام القديمة)، يستخدم خلاط الخلايا كما مادة نبات الناعمة. مع توافر التمويل نبات تي-دنا insertional المغلوب خطوط، الحاجة إلى أن تكون قادرة على تنقية الميتوكوندريا القيام بالدراسات الفنية قد استلزم استحداث طرق لعزل الميتوكوندريا من أوراق أو الجذر أو زهرة الأنسجة. عموما الأساليب المتقدمة لنباتات أخرى عملت جيدا7، مع يستوفوا طحن المواد التي تحتاج إلى تحسين. لنبات وهذا يمكن تحقيقه في مجموعة متنوعة من الطرق (انظر أدناه)، ويختلف بين أنواع الأنسجة (جذر مقابل إطلاق النار). كما يمكن أن يكون الأمثل استخدام الانحدار المستمر ككثافة الميتوكوندريا من مختلف الأجهزة أو مراحل النمو يعني يمكن أن تهاجر بشكل مختلف. وهكذا، لفصل الحد الأقصى يمكن أن كثافة التدرج المكرر لضمان تحقيق أفضل الانفصال.
مرة المنقي الميتوكوندريا يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات، بما في ذلك تجارب امتصاص البروتين والحمض الريبي النووي النقال وفحوصات نشاط الإنزيم وقياسات سلسلة التنفس وتحليل لطخة غربية. يمكن أيضا استخدام الميتوكوندريا المعزولة لتحليل الطيف الكتلي لوفرة البروتين. المستهدفة من رد فعل متعددة رصد التحليلات (MRM) يسمح للتحديد الكمي لتعريف البروتينات، ولكن تتطلب التنمية المقايسة كبيرة. على النقيض من ذلك، يوفر القياس الكمي بثنائي أو أخرى تسميات النظائر8، نهج اكتشاف في تحديد الاختلافات عبر البروتين الكامل التي يمكن استخدامها للكشف عن رؤى البيولوجية رواية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة، يترك عزلة الميتوكوندريا من نبات الغلال حتى 3 ملغ الميتوكوندريا من حوالي 80-100 3-النباتات 4-الأسبوع القديمة، على الرغم من أن غلة أكبر من 5 ملغ غالباً ما يمكن أن يتحقق مع طحن دقيق. يختلف مع ظروف نمو العائد ويقلل جذريا كما يترك سينيسسي، على الرغم من أن هيكل الميتوكوندريا ويبدو كذلك الإبقاء ع…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة وأيده “الأسترالية مجلس المركز المتميز للبحوث” في مصنع الطاقة علم الأحياء CE140100008، الأسترالية مجلس المستقبل زمالة بحثية (FT130100112) إلى MWM، وزمالة أبحاث لنن فيودور (ألكسندر فون همبولت مؤسسة، وألمانيا) لشبيبة.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
Referencias
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
