Summary

طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

تم تطوير طريقة بسيطة للحصول على استنساخ ناغورني-كاراباخ وخلية T من المرضى كايبف بكفاءة عالية وكمية صغيرة من الدم المحيطي، وجرعة منخفضة من إيل-2.

Abstract

قد وصفت عددا من الأساليب إنشاء خطوط الخلايا ناغورني كاراباخ للطن من المرضى الذين يعانون من مرض سرطان الغدد الليمفاوية أو ليمفاوية. هذه الأساليب تستخدم الخلايا المغذية، وتنقية الخلايا T أو ناغورني كاراباخ مع قدر من 10 مل دم، أو جرعة عالية من إيل-2. هذه الدراسة ويعرض طريقة جديدة مع استراتيجية قوية وبسيطة لإنشاء خطوط ناغورني-كاراباخ وخلية T باستزراع الطرفية الدم الخلايا وحيدات النوى (PBMC) مع إضافة إيل-2 البشري الماشوب (رحيل-2)، ويستخدم أقل من 2 مل دم الكامل. الخلايا يمكن أن تنتشر بسرعة في غضون أسبوعين، ويستمر لمدة أكثر من 3 أشهر. مع هذا الأسلوب، أنشئت خطوط ناغورني كاراباخ أو خلية تي 7 مع نسبة نجاح عالية. هذا الأسلوب بسيطة وموثوق بها، وينطبق على إنشاء خطوط الخلايا من المزيد من حالات سرطان الغدد الليمفاوية الخلية كايبف أو ناغورني كاراباخ/تي.

Introduction

فيروس ابشتاين-بار (EBV) في كل مكان ويصيب ليس فقط خلايا ب، ولكن أيضا تي والطبيعية الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل، الذي يسبب عددا من الأمراض المرتبطة EBV ناغورني كاراباخ/تي ليمفاوية (LPD) وسرطان الغدد الليمفاوية/اللوكيميا، مثل هيموفاجوسيتيك EBV المرتبطة ليمفوهيستيوسيتوسيس و extranodal ناغورني كاراباخ/تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية، ونوع الآنف وهيدرا فاكسينيفورمي مثل الأورام اللمفاوية العدوانية ناغورني-كاراباخ خلية اللوكيميا1،،من23. ومن بين هذه هو حادة نشطة EBV (سكايبف) الأمراض المزمنة، وهو الحادث أساسا في شرق آسيا، والذي يعتبر الآن LPD الناجم عن التوسع في الاستنساخ من المصابين EBV T أو ناغورني كاراباخ الخلايا4،5،6، 7، لكن من دون نقص المناعة الظاهر موجودة في كثرة الوحيدات العدوائيه (IM)-مثل الأعراض بما في ذلك الحمى وضخامة وتضخم العقد اللمفية والخلل في الكبد مستمر أو متكرر، فضلا عن ارتفاع EBV-الحمض النووي تحميل في الدم المحيطي8،9. المرضى الذين يعانون من كايبف سوء تشخيص10،11، والمرضية، ودور EBV غير واضح. ولذلك، الخلية الخطوط المشتقة من الأمراض المرتبطة EBV ناغورني كاراباخ/تي ليمفاوية والأورام الليمفاوية مفيدة جداً كنماذج الخلية لتوضيح إليه EBV الناجم عن انتشار الخلايا T أو ناغورني كاراباخ وعلاقتها مع ارتفاع عدد حالات سرطان الدم أو سرطان الغدد الليمفاوية.

وحتى الآن، تم إنشاء العديد من خطوط الخلايا مع تقنيات مختلفة12،،من1314،،من1516. خط خلية بشرية ناغورني-كاراباخ، ناغورني كاراباخ-يس، أنشأت من ناغورني كاراباخ الخلية اللمفاوية/اللوكيميا، استزراع يشترك مع خط خلية stromal ماوس كالتغذية، وحضور رحيل-2 بتركيز 20U كل مل15. KAI3 وكان آخر خط الخلية ناغورني كاراباخ المنشأة من سكايبف مع خط الخلية ليمفوبلاستويد الذاتي (LCL)، أو المرضى الذين يعانون من حساسية شديدة البعوض من الخلايا ب غيرت EBV، كالخلايا المغذية وإضافة لرحيل-2 في 100U/مل16. SNK6 و SNT8 مستمدة من أنسجة الورم الأنفي ناغورني كاراباخ/تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية المرضى عن طريق إضافة جرعة عالية من رحيل-2 (700U/mL)12. مع تقنية مماثلة، وكانت الخلية SNK-1 من المرضى كايبف، مثقف من ببمك عن طريق إزالة خلايا تي ومشيراً إلى 700U/مل من رحيل-213،17. وأنشئت عن طريق إزالة خلايا CD4 + و CD8 + الخلايا18SNT13 و SNT15. حتى الآن، الأخرى خطوط الخلية خلية تي وناغورني كاراباخ من المرضى LPD EBV ناغورني كاراباخ/تي كل ما وضعت مع هذا الأسلوب19.

عيوب الأساليب القائمة المذكورة أعلاه تتضمن توظيف الخلايا المغذية، واشتراط جرعة عالية من إيل-2، والاستفادة من قدر 10 مل كل الدم، أو تنقية الخلايا NK/T، والتي صعبة للغاية في العيادة المقرر أن ضرورة التحقق من أي نوع من أنواع الخلايا أن EBV خفية يصيب قبل بداية للثقافة. كما كايبف يحدث أساسا في الأطفال في آسيا، 10 مل الدم لا يسهل الحصول عليها في جميع المناطق. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير طريقة بسيطة جديدة مع نسبة نجاح عالية إنشاء خطوط ناغورني كاراباخ و/أو خلية T باستزراع ببمك من كايبف من المرضى باستخدام جرعة منخفضة من rhIL2 ووحدة تخزين 2 مل من الدم كله دون تغذية الخلايا. وقد أثبتت نتائج هذه الطريقة كفاءة عالية وتوفير الوقت.

Protocol

وأقر هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي، الأكاديمية الصينية للعلوم، والبروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لرفاهية الإنسان. ملاحظة: انظر الشكل 1 لتخطيطي لسير العمل. 1-عزل ببمك من المرضى كايبف …

Representative Results

بعد 3 أيام الثقافة أثناء إنشاء خطوط الخلايا والخلايا متعددة الأشكال تبدأ في الظهور (الشكل 2). بعد 7 أيام، خلايا تنمو بسرعة، كما يتم زيادة عدد وصلاحية الخلايا بمعدل مرتفع (الشكل 3). مجموعات صغيرة من الخلايا تكون واضحة للعيان بعد 10-14 يوما وتنمو،…

Discussion

وقد وضعت في هذا البروتوكول، تقنية جديدة لإنشاء خطوط الخلايا ناغورني كاراباخ للطن من الدم كله من المرضى كايبف. بالمقارنة مع الأساليب القائمة، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو بساطته ومتطلباتها فقط كمية صغيرة من الدم، في حين أنه يسلك بمعدل نجاح مرتفع وظروف جيدة لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذا العمل كان يؤيد مشاريع مفتاح من الأكاديمية الصينية للعلوم (كفزد-سويسري-205)، “الاستراتيجية البيولوجية موارد تكنولوجيا نظام الدعم للأكاديمية الصينية” للعلوم (كزبزكس-1 وزسب-004)، والمنح من “مؤسسة العلوم الوطنية في الصين” ( 81401640) وشنغهاي صندوق العلوم الطبيعية (14ZR1434800).

Materials

Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis

Referencias

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Play Video

Citar este artículo
Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).

View Video