Este protocolo estudia el papel de la quimiocina ligando de (motivo C-C) 5 (CCL5) en el hipotálamo mediante la entrega de un antagonista, CCL5 Met, en el cerebro de ratón utilizando un sistema de infusión de cerebro de bomba micro-osmótico. Esta inhibición transitoria de la actividad CCL5 interrumpido insulina hipotalámica señalización, conduce a la intolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina sistémica periférica.
Insulina regula el metabolismo de la sistemática en el hipotálamo y la respuesta de la insulina periférica. Una reacción inflamatoria en los tejidos adiposos periféricos contribuye al tipo 2 mellitus de la diabetes (T2DM) desarrollo y regulación del apetito en el hipotálamo. Receptor de chemokine Chemokine CCL5 y C C tipo 5 niveles (CCR5) se han sugerido para mediar la intolerancia a la arteriosclerosis y de la glucosa en diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Además, CCL5 desempeña un papel neuroendocrino en el hipotálamo regulando alimentos consumo y la temperatura corporal, por lo tanto, incitar a investigar su función en la señalización de insulina hipotalámica y la regulación del metabolismo de la glucosa periférica.
El sistema de infusión de cerebro de bomba micro-osmótico es una forma rápida y precisa manipular CCL5 función y estudiar su efecto en el cerebro. También proporciona una alternativa conveniente para generar un animal transgénico knockout. En este sistema, CCL5 señalización fue bloqueado por la infusión intracerebroventricular (ICV) de su antagonista, CCL5 Met, utilizando una bomba osmótica micro. La sensibilidad de la insulina y el metabolismo de glucosa periférica fue detectada por la prueba de tolerancia de glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia de insulina (ITT). Actividad de señalización de la insulina fue analizada luego por blot de proteína de las muestras de tejido de los animales.
Después de 7-14 días de infusión CCL5 Met, el metabolismo de la glucosa y la insulina sensibilidad fue deteriorada en ratones, como se ve en los resultados de la SOG y ITT. La fosforilación de IRS-1 serine302 aumentó y se redujo la actividad de Akt en neuronas hipotalámicas de ratones tras CCL5 inhibición. En conjunto, nuestros datos sugieren que bloquear CCL5 en el cerebro de ratón aumenta la fosforilación de IRS-1 S302 e interrumpe la señalización de insulina hipotalámica, conduce a una disminución en la función de la insulina en tejidos periféricos, así como la debilitación de glucosa metabolismo.
Insulina afecta a una gran variedad de tejidos incluyendo el cerebro. La insulina atraviesa la barrera hemato – encefálica, entra en sistema nervioso central (SNC) y se une con el receptor de insulina (IR) en el hipotálamo para regular el consumo de alimentos, la actividad comprensiva y respuesta de la insulina periférica. La inflamación crónica en los tejidos adiposos periféricos se ha propuesto contribuir al tipo 2 mellitus de la diabetes (T2DM), pero cómo estas reacciones inflamatorias afectan insulina señales en el hipotálamo para mediar la respuesta y glucosa intolerancia a la insulina sistémica sigue siendo confuso. Algunas quimiocinas participan en la regulación del apetito y la regulación de la temperatura del cuerpo en el hipotálamo1 como factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), interleukin (IL) -6, IL-1β, monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) y CCL5 (ligando de adorno C C 5 ). Además, la inflamación en el hipotálamo conduce a resistencia a la insulina en T2DM2,3.
Entre estas quimiocinas, la alteración de los niveles de expresión de quimioquinas CCL5 y su receptor CCR5, en tejidos adiposos se ha asociado con intolerancia a la glucosa y arterioesclerosis en T2DM en seres humanos como en animales. CCL5 también tiene funciones neuroendocrinas, incluyendo la regulación de la temperatura de entrada y el cuerpo los alimentos, en el hipotálamo. Por lo tanto es importante investigar si CCL5 participa en la activación de señales de insulina en el hipotálamo o en los tejidos periféricos.
Señalización de insulina es regulada firmemente dentro de las células. La Unión de receptores de la insulina a la insulina (IR) activa las proteínas sustrato (IRS) de la insulina receptor, seguidas de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y proteína quinasa B (PKB/AKT) activación y glucosa transportador-4 (GLUT4) membrana translocación4 . Las proteínas IRS son los reguladores principales en esta vía de señalización: tienen múltiples residuos de tirosina y serina, que pueden ser phosphorylated en respuesta al positivo o negativo insulina señales5. Por ejemplo, la fosforilación de la serina 302 en IRS-1 puede conducir a la disociación física de IRS-1 de IR y bloquean la transducción de la señal de insulina, conduce a la resistencia de insulina6. El deterioro de la actividad de las proteínas IRS en el hipotálamo se ha demostrado para inducir resistencia a la insulina y la intolerancia a la glucosa en ratones7.
Una manera común de estudiar la función de un gen específico es la manipulación de la expresión de genes de la blanco distribuidos a lo largo de todo el cuerpo del organismo. Sin embargo, esto puede tener varios inconvenientes: 1) que podría generar efectos regulatorios o compensatorio comentarios diferentes en el tiempo y 2) este método no nos ayuda a ilustrar el papel de la proteína diana en las regiones específicas del cerebro. También, tejidos y células específicos gene nocaut animales tardan mucho tiempo para criar y son costosos. Por lo tanto, utilizamos un a corto plazo sistema de bomba osmótica infusión cerebro – una forma relativamente rápida y conveniente para interferir con la señalización de la proteína diana en el cerebro usando la droga antagonista para superar los temas antes mencionados. Estereotácticas inyecciones solía requieren intrincada habilidad quirúrgica y grandes inversiones en instrumentación y tiempo. En este protocolo, le ofrecemos una manera simple y segura para realizar la inyección stereotactic y un método rápido, menos dañino e instantáneo para detectar la concentración de glucosa en sangre e investigar el papel de CCL5 en insulina hipotalámica Reglamento de señalización.
El mecanismo de la inflamación crónica y quimiocinas relacionados como CCL5 y su receptor – CCR5 en el desarrollo de diabetes tipo 2 sigue siendo confuso. La inflamación crónica causa la infiltración de macrófagos en los tejidos adiposos y afecta a la regulación de los adipokines; mientras tanto, también atrae a las células β y deteriora la secreción de insulina de los islotes de Langerhans en respuesta a la glucosa en la sangre. Hipotálamo en el cerebro desempeña un papel importante como un centro de control en la coordinación de señales de insulina y adipoquinas desde los tejidos periféricos sistémicos en la regulación del apetito, metabolismo de la glucosa de sangre periférica y la respuesta de la insulina. Muchos estudios también indican que la inflamación hipotalámica conduce a la defectuosa regulación de la homeostasis de energía así como defectuoso islote pancreático y función hepática2,3,9,10. CCL5 en el cerebro contribuye a la regulación de alimentos entrada y cuerpo de temperatura en el hipotálamo11,12; sin embargo, la correlación de CCL5 para señalización de la insulina hipotalámica y sistémica es incierta. Un ratón de nocaut de cuerpo entero CCL5 (CCL5– / –) se ha generado para abordar esta cuestión, que muestra un fenotipo de resistencia de insulina con niveles más altos de insulina y los altos niveles de glucemia en sangre8. Sin embargo, requiere mucho tiempo para desarrollar el fenotipo de T2DM y es difícil de investigar la función y mecanismo de CCL5 en señal de insulina hipotalámica debido a posibles efectos compensatorios a largo plazo. Por lo tanto, una manipulación directa de CCL5 señalización en neuronas hipotalámicas es el mejor enfoque. Sin embargo, hay varios tipos de neuronas en la región hipotalámica y es bastante costoso y desperdiciador de tiempo generar ratones knockout específicas de la célula. Sistema de infusión utilizando un ICV puede así ahorrar tiempo y ofrecer un enfoque más específico para manipular CCL5 función directamente en el cerebro, evitando posibles reacciones inflamatorias periféricas.
Estudios utilizando bombas osmóticas han sido publicados anteriormente, proporcionando ejemplos y demostraciones de técnicas involucradas en la implantación de bombas de osmóticas en roedores13. Sin embargo, nos enfrentamos a unos retos siguiendo estos protocolos en nuestro estudio. En primer lugar, algunos de los equipos utilizados en el protocolo es bastante caro, incluyendo 1) el sistema eléctrico para llegar a la ubicación, el dibujo y la inserción de la aguja en cerebro de ratón, 2) el sistema de termo para mantener la temperatura corporal del ratón y 3) el oxígeno-isoflurano suministro de sistema para la administración de anestesia a los ratones. En segundo lugar, las técnicas descritas en otros artículos eran difíciles de replicar ya que solamente hemos podido utilizar animales dentro de una gama pequeña de pesos corporales y a ciertas edades para nuestro estudio. Somos conscientes de que los ratones más grandes son más convenientes para la cirugía y la implantación. Sin embargo, en nuestro estudio, tuvimos que utilizar ratones más pequeños y más jóvenes para evitar el sobrepeso y los efectos del envejecimiento sobre la regulación de glucosa insulina y sangre: sólo ratones machos con el cuerpo peso 25 ± 2 g y la edad de alrededor de 2 meses de edad fueron escogidos en el estudio. Por lo tanto, es difícil realizar la cirugía y la sutura de la herida en la cabeza de ratón. En tercer lugar, la respuesta inflamatoria tiene que reducirse después de la cirugía ya que una citoquina inflamatoria es el objetivo de este estudio. Las ratas y ratones pueden quitar la sutura y heridas abiertas fácilmente después de la cirugía, que resultan en inflamación y aumentar las reacciones de chemokine. Por lo tanto, es necesaria una estrategia para llegar a la situación y sacar e introducir la aguja en cerebro de ratón que evita infección secundaria. Por lo tanto, modificamos los protocolos previamente descritos para hacer esta técnica eficaz, más fácil y menos perjudiciales a los animales, como se describe en el párrafo siguiente.
En primer lugar, se utilizó un taladro del clavo para perforar manualmente un agujero en el área del objetivo marcado en el cráneo, como se describe en el paso 2.6. Este método es eficaz y nos permite controlar todo el proceso para evitar dañar las meninges de ratón y los vasos sanguíneos. Regulación de la glucosa de sangre se deteriora después de un accidente cerebrovascular agudo, como una hemorragia en el cerebro. Hiperglucemia aguda y los síndromes parecidos a la diabetes también se observaron después del accidente cerebrovascular en ajustes clínicos14,15. Del mismo modo, también se encontró respuesta de insulina y el nivel de intolerancia a la glucosa en ratones con hemorragia y pus en el cerebro. Somos conscientes de que el mejor control de la cirugía basada en el manual es necesario para asegurar la consistencia de los resultados. En segundo lugar, aprovechó de un nuevo biomaterial médico utilizado en clínicas, pegamento adhesivo de tejido (paso 2.8), para sellar la piel en la cabeza del ratón después de la cirugía, por lo tanto, evitando puntos y acelera la tasa de curación. Esto hace más fácil de realizar procedimientos quirúrgicos y reduce la posibilidad de inflamación secundaria. En tercer lugar, el tiempo necesario para llevar a cabo todo el procedimiento quirúrgico es relativamente más corto, que aumenta la probabilidad de supervivencia de los ratones y disminuye la dosis de fármaco anestésico se inyecta por vía intraperitoneal. Se observó una tasa de supervivencia alta (95%) y se obtuvieron resultados relativamente precisos siguiendo este protocolo modificado.
La limitación de esta técnica es el relativamente corto tiempo de entrega de la droga. Aunque una bomba osmótica puede ser colocada en el cuerpo del ratón alternativamente sin volver a abrir el cerebro, nuestro estudio sólo se centra en el efecto de quimioquinas inflamatorias en el cerebro para regular la señalización de insulina sistémica periférica. Cirugía adicional en los tejidos periféricos posiblemente podría inducir una reacción inflamatoria en los tejidos periféricos, que luego aumentaría la expresión de quimioquinas inflamatorias y afectar los resultados. En segundo lugar, la vida media del fármaco también limita la duración del estudio. Proteínas recombinantes como chemokine generalmente tienen una vida media más corta, que pierde su actividad con el tiempo, aunque también nos permite estudiar el efecto de bloqueo CCL5 señalización en el cerebro a corto plazo. Nuestros estudios anteriores también han descrito un enfoque de modificación genética para la generación de un ratón knockout CCL5, lo que proporciona un modelo de efectos a largo plazo8.
Hay algunas nuevas técnicas y métodos alternativos para administrar medicamentos en el cerebro. La nanotecnología es una técnica poderosa, que puede utilizarse para administrar medicamentos en el sistema nervioso central. Sin embargo, muchas drogas son termosensibles y pueden ser destruidas cuando se trata de paquete en nanopartículas16. Además, las nanopartículas pueden pasar a través de BBB y ser captados por las células que son convenientes para el siRNA o medicamentos más comunes, pero no es un método ideal para el atascamiento del ligand-receptor.CCL5 requiere unión a su receptor CCR5, en las neuronas del ARC hipotálamo para tomar efecto8, y la entrega de CCL5 antagonista CCL5 Meten las neuronas a través de nanopartículas puede causar una pérdida de la capacidad de enlazar y bloquear CCR5 en la célula superficie.
El nivel de glucosa en sangre fue significativamente mayor en los ratones administrados con el antagonista CCL5 MetCCL5 en comparación con los controles (ratones administrados con aCSF) en la prueba de tolerancia oral a la glucosa. Administración de insulina adicional (prueba de tolerancia a insulina) también era incapaz de bajar el nivel de glucemia en MetCCL5 recibir ratones (Figura 4B), que sugiere que la insulina endógena y externa no puede reducir niveles de glucosa en sangre Cuando el bloqueo hipotalámico CCL5 señalización. Ratones se convirtió en resistencia a la insulina sin CCL5 actividad en el hipotálamo. Serine302 aumento de fosforilación de IRS-1 se encontró en los ratones recibiendo Met-CCL5 en comparación con ratones control recibiendo aCSF (figura 5A-B). Fosforilación de la serina 302 de IRS-1 se ha demostrado para inducir una disociación física de IRS-1 del receptor de insulina, que es una causa importante de insulina resistencia6; la insulina es incapaz de activar las señales descendentes como la vía de la PI3K-Akt. Un estudio ex vivo insulina estimulación confirmó la insulina molécula aguas abajo de señalización Akt (p-AktS473) no se ha activado por la insulina en el tejido hipotalámico ratón infundido con Met-CCL5 y, en cambio, aumentó la fosforilación de serina 302. En conjunto, datos fisiológicos (OGTT y ITT) y estudio molecular demuestran que hipotalámico CCL5 señalización interviene en la regulación de la señal de insulina hipotalámica, que contribuye al metabolismo de glucosa y la resistencia de la insulina sistemática.
El papel y el mecanismo de CCL5 y CCR5 en la diabetes asociada a obesidad sigue siendo confuso. Kitade et al reportó que la deficiencia CCR5 protegido ratones de inflamación inducida por la obesidad, el reclutamiento de macrófagos e insulina resistencia17. Sin embargo, otros estudios realizados por Kennedy et al encontraron resultados opuestos que indican que la deficiencia CCR5 deteriora la tolerancia a la glucosa sistémica así como músculo y adipocito insulina señalización18. Ambos estudios aplican una dieta alta en grasas para inducir a la obesidad, que lleva a la inflamación crónica de todo el cuerpo y la respuesta compensatoria. Estos estudios no proporcionaron mecanismos limpios y claros de CCL5 y CCR5 en Reglamento de señalización de la insulina. Por otro lado, la técnica de bomba osmótica permite una infusión específica del cerebro y evita respuesta compensatoria con su entrega de tiempo limitado.
En conclusión, aunque la bomba osmótica con el sistema de infusión cerebral parece ser una técnica “antigua”, proporcionan un método más barato, más fácil y menos dañino de la entrega de la droga y ayuda a investigar la función de ligando-receptor en la cerebro.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos el apoyo del Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán – suplemento MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), salud y bienestar de productos de tabaco – MOHW106-TDU-B-212-144001 a S Y C.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
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Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |