Esta publicación describe la fabricación de un dispositivo de órgano-en-viruta con electrodos integrados para la cuantificación directa de la resistencia eléctrica transendothelial (TEER). Para la validación, la barrera blood – brain fue imitada dentro de este dispositivo de microfluidos y supervisaron su función de barrera. Los métodos presentados para electrodo integración y cuantificación de TEER directa son generalmente aplicables.
Órganos en chips, en vitro modelos que involucran el cultivo de tejidos (humanos) dentro de dispositivos microfluídicos son rápidamente emergentes y la promesa de proporcionar útiles de investigación herramientas para el estudio de la enfermedad y la salud humana. Para caracterizar la función de barrera de capas cultivadas dentro de dispositivos de órgano-on-chip, se mide a menudo transendothelial o transepitelial resistencia eléctrica (TEER). Con este fin, electrodos generalmente están integrados en el chip por métodos de micromecanizado para proporcionar mediciones más estables que se consigue con la inserción manual de los electrodos en las entradas de la viruta. Sin embargo, estos electrodos con frecuencia dificultan la inspección visual de la capa de células estudiadas o requieren cleanroom costosos procesos para la fabricación. Para superar estas limitaciones, el dispositivo descrito aquí contiene cuatro electrodos fácilmente integrados que se colocan y se fija fuera del área de cultura, haciendo posible la inspección visual. Usando estos cuatro electrodos que puede cuantificar la resistencia de seis rutas de medición, de la cual el TEER puede ser directamente aislado, independiente de la resistencia de microcanales llenos de medio de cultivo. La barrera blood – brain fue replicada en este dispositivo y su TEER fue supervisado para demostrar la aplicabilidad del dispositivo. Este chip, los electrodos integrados y el método de determinación de TEER son generalmente aplicables en órganos en fichas, para imitar a otros órganos o a ser incorporados en los sistemas de órgano en el chip.
Órganos-on-chips son rápidamente emergiendo como una nueva y prometedora clase de in vitro modelos de tejido. 1 en estos modelos, las células se cultivan dentro de dispositivos de microfluidos que están diseñados de tal manera que imitan el microambiente fisiológico de las células. 1 , 2 el resultado más realista comportamiento fisiológico o patológico de las células que se puede esperar de los modelos convencionales en vitro de diseño simple y funciones básicas. 3 , 5 , 6 además, órganos en fichas proporcionan un mejor ambiente controlable que en vivo los modelos y pueden incorporar tejido sano y enfermo de origen humano para replicar fielmente la patología y fisiología humana. Los avances recientemente resumidos en el desarrollo de barreras de sangre – cerebro en chips (BBBs en virutas) muestran que el campo está avanzando rápidamente hacia adelante. 7
Otra ventaja de órganos en fichas es que permiten monitoreo en tiempo real y continuo del tejido cultivado dentro del dispositivo por microscopía, análisis bioquímicos en línea y sensores integrados. 1 , 2 por ejemplo, medición de resistencia eléctrica transendothelial o transepitelial (TEER) es un método eficaz para el control de forma no invasiva el desarrollo y la interrupción de la formación de barrera de los tejidos. 8 , 9 , 10 TEER es la resistencia eléctrica a través de una barrera celular y por lo tanto es indicativo de la integridad de la barrera y la permeabilidad. 10 órganos en astillas las barreras celulares se cultivan generalmente en una membrana que separa dos canales fluídicos, que representa el apical y basolateral compartimientos de ese tejido de barrera. En tales fichas, mediciones de TEER pueden realizarse convenientemente con electrodos insertados en las entradas y salidas de los dos canales. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 sin embargo, inserción manual y reinserción de los electrodos pueden fácilmente resultar en errores de colocación y en las variaciones en la resistencia como por ejemplo las diferencias en la resistencia de los caminos más largos o más cortos a través de microcanales son significativos en comparación con la resistencia de la barrera de la célula. 16 para eliminar errores de reinserción, aparatos con electrodos integrados se han propuesto. Sin embargo, la mayoría de estos electrodos integrados bloquean la vista, al inspeccionar el cultivo de tejidos17,18,19,20,21 o requieren especializados sala de procesos para la fabricación. 17 , 22
El dispositivo de órgano-en-viruta descrito en esta publicación, aplicado por primera vez en una publicación anterior,16 combina la estabilidad de los electrodos integrados con visibilidad en la capa de la célula medida y la facilidad de fabricación. El diseño y la fabricación de este chip se muestra en la figura 1. En Resumen, este aparato consta de dos partes de polidimetilsiloxano (PDMS) con las impresiones del canal que son enlazadas juntos libre de fugas con una membrana de policarbonato con 0.4 μm los poros en el medio. Cuatro electrodos de alambre de platino se introduce y fija en su lugar con un fotocurables adhesivo bien fuera del área de cultura. Todos estos pasos de fabricación pueden realizarse con equipos de laboratorio, sin necesidad de un ambiente de sala limpia. Además de esto, se pueden hacer seis mediciones de impedancia utilizando estos cuatro electrodos, permitiendo aislamiento directo de medida TEERAN, independiente de la resistencia de los microcanales conduce a la sección transversal y así minimizar la influencia de variaciones no-biológicos en el sistema tales como (re) errores de inserción. 16
Para demostrar la aplicabilidad de este dispositivo y las mediciones directas de TEER, que la barrera blood – brain (BBB) fue replicada en este chip. Esta barrera biológica consiste en células endoteliales especializadas y regula el transporte entre sangre y cerebro para proporcionar la homeostasis cerebral. 23 , 24 para imitar la BBB, el canal superior del dispositivo microfluídico fue alineado con células endoteliales microvasculares cerebrales humanas de la línea celular hCMEC/D3 (proporcionado amablemente por el Dr. P.-O. Couraud, INSERM, París, Francia). 25 el método presentado es, sin embargo, más generalmente aplicable a cualquier dispositivo de órgano-on-chip con dos compartimientos, permitiendo la determinación directa de TEER utilizando fácilmente integrados electrodos.
En este manuscrito, primero se describe el proceso de fabricación del dispositivo de órgano-en-viruta con electrodos integrados. Siguiente, el procedimiento siembra y cultivo de células endoteliales cerebrales dentro del aparato se explica, así como las medidas de TEER la en-viruta. En la sección de resultados, se muestran mediciones representativas de TEER y procesamiento de datos se clarifica. Por último, la función de barrera de la BBB-on-chip, monitoreado durante 3 días, se presenta, demostrando la aplicabilidad de los métodos para monitorear TEER y dispositivo presentado.
En este manuscrito, se presentaron la ingeniería de un dispositivo de órgano-on-chip y la determinación directa de la resistencia eléctrica de transendothelial (TEER) una barrera celular cultivado en el dispositivo. El método presentado de la integración de electrodos sin equipo de sala limpia y la determinación directa de TEER usando cuatro electrodos es aplicable a cualquier dispositivo de órgano-on-chip con dos compartimentos de microfluidos. El diseño de chip y la geometría pueden ser adaptados para caber los requisitos de los experimentos previstos, mientras los cuatro electrodos se separan en dos compartimientos. Los cuatro electrodos pueden incluso convenientemente insertarse en las entradas de fichas existentes, siempre y cuando se fijación en lugar por la duración de las mediciones de seis. El método de unión libre de fugas puede optimizarse para diferentes membranas y geometrías canal cambiando la proporción PDMS/tolueno. Un mayor contenido de tolueno resulta en una capa de recubrimiento centrifugado más fina de mortero26 y puede ser más conveniente para los canales de menos y más estrechos en las partes PDMS. Un menor resultados contenido tolueno en un mortero más grueso capa26 y pueden ser más adecuados incluir más gruesas membranas entre las partes PDMS.
Como puede verse en los espectros de impedancia esquemática en la figura 2A y los espectros experimentales Figura 2E y 2F, las mediciones de impedancia son influenciadas por la capacitancia de doble capa en la interfase electrodo-medio. Debido al pequeño tamaño de los electrodos dentro de los microcanales, la capacitancia de doble capa puede dominar sobre la meseta resistente de la barrera celular en espectros de impedancia, que complica la cuantificación de la TEER. Para superar esto, se pueden insertar los electrodos en los canales de cultura antes de la fijación. Esto aumentará la superficie del electrodo expuesto al medio de cultivo y con que la capacitancia de doble capa se incrementará también. Esto resulta en un cambio de la pendiente capacitiva a frecuencias más bajas, por lo que la meseta resistente de la barrera celular puede ser más fácilmente reconocido y cuantificado. Aunque la resistencia de la vía medida entre dos electrodos será menor, esto no influirá en la cuantificación de TEER siguiendo el método presentado.
Durante la medición a través de la barrera celular, es posible que no se puede reconocer la meseta extra resistente. Esto puede ser el resultado de una conexión fluídica entre los dos canales, por ejemplo, si la membrana está mal cerrada por el mortero, conduce a un trazado medido alrededor de la barrera celular. Además, puede haber un puente eléctrico fuera de la viruta si los electrodos son conectados por una gota de medio de cultivo. Esto generalmente se combina con una impedancia inferior medida y puede resolverse mediante la eliminación de esta puente de medio de cultivo. Por último, si hay no hay meseta resistiva y la impedancia medida es órdenes de magnitud mayores de lo esperado, puede ser una conexión suelta en el cableado o en la fuente de alimentación.
En el futuro, se puede aumentar la relevancia fisiológica de la BBB-on-chip actual exponiendo las células endoteliales para distorsionar el estrés a nivel fisiológico, que se divulga para promover la tirantez BBB diferenciación y aumento de la barrera y es difícil de lograr en modelos convencionales en vitro . 29 además, el canal de la parte inferior del dispositivo presentado proporciona un compartimiento conveniente para las células derivadas de cerebro ser cultivadas conjuntamente con el endotelio. Esto también se espera que aumente la función de barrera y también permite el estudio de las complejas interacciones entre los tipos de células relevantes en condiciones patológicas. 29
En conclusión, el órgano-en-viruta descritos en esta publicación pueden ser fabricados usando equipo normal de laboratorio y se muestra para proporcionar mediciones directas de TEER usando cuatro electrodos integrados que impiden la inspección visual de la célula estudiada capa. La aplicabilidad de este dispositivo en el campo de órganos-on-chips fue demostrada por mímico el BBB en este chip y seguimiento el TEER durante el período de cultivo. Un anfitrión de otros órganos (barrera) se puede mímico por incluyendo otros tipos de células relevantes en este chip. Además, el método para medir TEER puede aplicarse fácilmente en otros dos compartimiento-órgano-en-viruta dispositivos para llegar a valores TEER reproducibles y significativos que pueden compararse a través de dispositivos y sistemas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Johan Bomer para fabricación del molde y Mathijs Bronkhorst para discusiones fructíferas y asistencia a la representación de los datos.
Esta investigación fue financiada por: SRO microdispositivos de L.I. Segerink, MIRA Instituto de biomédica de la ingeniería biomédica y la medicina técnica, Universidad de Twente; SRO órganos-on-Chips de A.D. van der Meer, MIRA Instituto de ingeniería biomédica y la medicina técnica, Universidad de Twente; y VESCEL, ERC Advanced Grant a A. van den Berg (grant no. 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |