Questa pubblicazione descrive la realizzazione di un dispositivo di organo-on-chip con elettrodi integrati per quantificazione diretta della resistenza elettrica transendoteliale (TEER). Per la convalida, la barriera emato – encefalica è stata imitata all’interno di questo dispositivo microfluidico e sua funzione di barriera è stata controllata. I metodi presentati per integrazione di elettrodo e diretto TEER quantificazione sono generalmente applicabili.
Organi-on-chip, in vitro modelli che coinvolgono la cultura dei tessuti (umani) all’interno di dispositivi microfluidici, sono rapidamente emergenti e promessa di fornire utili strumenti di ricerca per lo studio della malattia e della salute umana. Per caratterizzare la funzione di barriera di strati di cellule coltivate all’interno di dispositivi organo-on-chip, è misurata spesso transendoteliale o transepiteliale resistenza elettrica (TEER). A tal fine, gli elettrodi sono solitamente integrati il chip microlavorazioni metodi per fornire misure più stabile che si ottiene con inserimento manuale degli elettrodi nelle insenature del chip. Tuttavia, questi elettrodi frequentemente ostacolano ispezione visiva dello strato delle cellule studiate o richiedono cleanroom costosi processi di fabbricazione. Per superare questi limiti, il dispositivo descritto qui contiene quattro elettrodi facilmente integrati che vengono inseriti e fissati all’esterno dell’area di cultura, rendendo possibile il controllo visivo. Utilizzando questi quattro elettrodi che la resistenza dei sei percorsi di misurazione può essere quantificata, da cui il TEER può essere direttamente isolato, indipendente della resistenza dei microcanali riempiti di terreno di coltura. La barriera emato – encefalica è stata replicata a questo dispositivo e sua TEER è stato monitorato per mostrare l’applicabilità del dispositivo. Questo chip, gli elettrodi integrati e il metodo di determinazione di TEER sono generalmente applicabili in organi-on-chip, sia per imitare altri organi o per essere incorporati nei sistemi esistenti di organo-on-chip.
Organi-on-chip sono rapidamente emergendo come una nuova e promettente classe di in vitro modelli di tessuto. 1 in questi modelli, le cellule sono coltivate all’interno di dispositivi microfluidici che sono progettati in modo tale che imitano il microambiente fisiologico di quelle cellule. 1 , 2 il risultato più realistico comportamento fisiologico o patologico di quelle cellule che può essere previsto dai modelli convenzionali in vitro del design semplice e funzione di base. 3 , 5 , 6 inoltre, organi-on-chip forniscono un migliore ambiente controllabile rispetto ai modelli in vivo e può incorporare sia sani che malati dei tessuti di origine umana per replicare fedelmente la patologia e fisiologia umana. I progressi recentemente riassunti nello sviluppo di sangue – cervello barriere su chip (BBBs-on-chip) mostrano che il campo sta rapidamente muovendo in avanti. 7
Un altro vantaggio di organi-on-chip è che essi consentono un monitoraggio in tempo reale e continuo del tessuto coltivato all’interno del dispositivo di microscopia, le analisi biochimiche on-line e sensori integrati. 1 , 2 ad esempio, la misura resistenza elettrica transendoteliale o transepiteliale (TEER) è un metodo potente per il monitoraggio non invasivo lo sviluppo e la rottura della barriera-formando tessuti. 8 , 9 , 10 TEER è la resistenza elettrica attraverso una barriera cellulare ed è quindi indicativo della permeabilità e l’integrità della barriera. 10 in organi-on-chip, barriere cellulari sono generalmente coltivate su una membrana che separa due canali fluidici, che rappresenta l’apicale e basolaterale scomparti di quel tessuto barriera. In questi chip, TEER misurazioni possono essere effettuate comodamente con elettrodi inseriti a Monte e a valle dei due canali. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 tuttavia, inserimento manuale e reinserimento degli elettrodi può facilmente causare errori di posizionamento e quindi variazioni nella resistenza misurata come ad esempio le differenze nella resistenza di percorsi più lunghi o più brevi tramite microcanali sono significative rispetto alla resistenza della barriera delle cellule. 16 per eliminare errori di reinserimento, dispositivi con elettrodi integrati sono stati proposti. Tuttavia, la maggior parte di questi elettrodi integrati blocca la vista quando si ispeziona le colture tissutali17,18,19,20,21 e/o richiedere specializzato Cleanroom processi per la fabbricazione. 17 , 22
Il dispositivo di organo-on-chip descritto in questa pubblicazione, in primo luogo applicata in una precedente pubblicazione,16 combina la stabilità degli elettrodi integrati con visibilità sulla strato delle cellule misurata e montaggio facile. La progettazione e la fabbricazione di questo chip è raffigurato nella Figura 1. In breve, questo dispositivo è costituito da due parti di polidimetilsilossano (PDMS) con impronte di canale che sono legati insieme privo di perdite con una membrana di policarbonato con 0,4 µm pori in mezzo. Quattro elettrodi di platino filo inseriti e fissati in posizione con un fotocurabili adesivo ben di fuori della zona di coltura. Tutti questi passaggi di fabbricazione può essere condotta con apparecchiature di laboratorio generale, senza la necessità di un ambiente di camera bianca. In cima a questo, sei misure di impedenza possono essere fatto utilizzando questi quattro elettrodi, consentendo in tal modo isolamento diretto di TEER misurato, indipendente della resistenza dei microcanali che conduce fino alla sezione trasversale e riducendo al minimo l’influenza di variazioni non biologiche nel sistema come (ri) errori di inserimento. 16
Per mostrare l’applicabilità di questo dispositivo e le misure dirette di TEER, che emato – encefalica (BBB) è stata replicata in questo chip. Questa barriera biologica è costituito da cellule endoteliali specializzate e regola il trasporto tra sangue e cervello per fornire l’omeostasi del cervello. 23 , 24 per simulare la BBB, il canale superiore del dispositivo microfluidico è stato allineato con le cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane dalla linea cellulare hCMEC/D3 (gentilmente fornito dal Dr. P.-O. COURAUD, INSERM, Paris, France). 25 il metodo proposto è, tuttavia, più in generale applicabile a qualsiasi dispositivo di organo-on-chip con due scomparti, consentendo la determinazione diretta di TEER facilmente utilizzando integrato elettrodi.
In questo manoscritto, in primo luogo il processo di fabbricazione del dispositivo organo-on-chip con elettrodi integrati è descritto. Avanti, la procedura di semina e la cultura delle cellule endoteliali cerebrali all’interno del dispositivo è spiegato, così come le misure di TEER su chip. Nella sezione risultati, misurazioni rappresentative TEER sono mostrati e trattamento dei dati è chiarito. Infine, la funzione di barriera della BBB-on-chip, monitorato durante 3 giorni, si presenta, mostrando l’applicabilità del dispositivo presentato e metodi per monitorare TEER.
In questo manoscritto, sono stati presentati la progettazione di un dispositivo di organo-on-chip e la determinazione diretta della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) di una barriera cellulare coltivata nel dispositivo. Il metodo proposto di integrare gli elettrodi senza attrezzature per camere bianche e la determinazione diretta di TEER utilizzando quattro elettrodi è applicabile a qualsiasi dispositivo di organo-on-chip con due scomparti di microfluidica. Il layout a chip e la geometria può essere adattati per soddisfare le esigenze degli esperimenti immaginati, fintanto che i quattro elettrodi sono separati in due scomparti. Quattro elettrodi anche possono essere comodamente inseriti nelle insenature di chip esistenti, purché essi sono fissati in posizione per tutta la durata di sei misurazioni. Il metodo di incollaggio trafilamenti può essere ottimizzato per diverse membrane e canale geometrie modificando il rapporto PDMS/toluene. Un maggiore contenuto di toluene si traduce in uno strato più sottile di spin-rivestito di mortaio26 e potrebbe essere più adatto per canali meno profondi e più stretto nelle parti PDMS. Un risultati di contenuto toluene inferiori in un mortaio più spesso strato26 e potrebbe essere più adatto per racchiudere le membrane più spessore tra le parti PDMS.
Come si può vedere gli spettri di impedenza schematica in Figura 2A e gli spettri sperimentali in Figura 2E e 2F, le misure di impedenza sono influenzate dalla capacità doppio strato all’interfaccia elettrodo-medio. A causa delle piccole dimensioni degli elettrodi all’interno i microcanali, la capacità di doppio strato può dominare sopra l’altopiano resistivo della barriera cellulare negli spettri di impedenza, che complica la quantificazione del TEER. Per ovviare a questo, gli elettrodi possono essere inseriti ulteriori nei canali di cultura prima della fissazione. Ciò consentirà di aumentare la superficie dell’elettrodo esposto al terreno di coltura e con che la capacità di doppio strato aumenterà pure. Ciò provoca uno spostamento del versante capacitivo a frequenze più basse, così che l’altopiano resistivo della barriera cellulare può essere più facilmente riconosciuto e quantificati. Anche se la resistenza del percorso misurata tra due elettrodi diventerà più piccola, questo non influenzerà la quantificazione di TEER seguendo il metodo proposto.
Mentre si misura attraverso la barriera cellulare, è possibile che l’altopiano extra resistivo non può essere riconosciuto. Questo può essere il risultato di una connessione fluidico tra i due canali, ad esempio se la membrana è scarsamente racchiuso dal mortaio, che conduce a un percorso misurato intorno alla barriera cellulare. Inoltre, ci possono essere elettrici bridging fuori il chip se gli elettrodi sono collegati da una goccia di terreno di coltura. Questo è generalmente in combinazione con una bassa impedenza misurata e può essere risolto rimuovendo questo ponte di mezzo di coltura. Infine, se non c’è nessun altopiano resistivo e l’impedenza misurata è ordini di grandezza superiori al previsto, potrebbe esserci un collegamento allentato nel cablaggio elettrico o alla fonte di alimentazione.
In futuro, la rilevanza fisiologica della corrente BBB-on-chip può essere aumentata esponendo le cellule endoteliali per shear stress a livelli fisiologici, che è segnalato per promuovere la tenuta di barriera di differenziazione e aumento BBB ed è difficile da raggiungere nei modelli convenzionali in vitro . 29 il canale inferiore del dispositivo presentato fornisce inoltre un apposito alloggiamento per le cellule di cervello-derivato di co-coltura con l’endotelio. Questo prevede inoltre di aumentare la funzione di barriera ed inoltre permette lo studio delle complesse interazioni tra tipi cellulari rilevanti nelle circostanze patologiche. 29
In conclusione, il dispositivo di organo-on-chip descritto in questa pubblicazione possa essere fabbricato con normale attrezzatura da laboratorio ed è indicato per fornire misurazioni dirette di TEER utilizzando quattro elettrodi integrati che non ostacolino il controllo visivo della cella ha studiata strato. L’applicabilità di questo dispositivo nel campo organi-on-chip è stato dimostrato che imita la BBB in questo chip e monitorando il TEER durante il periodo di coltura. Un host di altri organi (barriera) può essere imitato includendo altri tipi cellulari rilevanti in questo chip. Inoltre, il metodo per la misurazione TEER può essere applicato facilmente in altri due dispositivi di organo-on-chip basati su vano per arrivare a valori TEER riproducibili e significativi che possono essere confrontati su dispositivi e sistemi.
The authors have nothing to disclose.
Noi riconosciamo con gratitudine Johan Bomer per la fabbricazione della muffa e Mathijs Bronkhorst per discussioni fruttuose e assistenza con rappresentazione dei dati.
Questa ricerca è stata finanziata da: SRO microdispositivi di L.I. Segerink, MIRA istituto biomedico per ingegneria biomedica e tecnica di medicina, Università di Twente; SRO organi-on-chip di A.D. van der Meer, MIRA Istituto di ingegneria biomedica e tecnica di medicina, Università di Twente; e VESCEL, ERC Advanced Grant di A. van den Berg (grant No. 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |