Kvantifisering av Monocyte Transmigration og skum celle formasjon fra personer med kronisk opphissende vilkårene

Monocytt transmigration er et viktig skritt i utviklingen av aterosklerotisk plakk som kan føre til hjerteinfarkt, blodpropp og slag. Aterosklerotisk plaketter utvikle fra fet striper, generelt finnes på nettsteder av lav oscillasjon blodstrøm i middels til store arteriene, der avsatt lipid bidrar til endotelial aktivisering og lokalisert betennelse¹. Monocytter er rekruttert til endotelceller i fet striper via monocyte chemotactic proteiner (for eksempel CCL2) og transmigrate i intima². Etter transmigration, kan monocytter danne atherogenic, lipid-laden makrofager kalt skum celler av lipid opptak, lipid syntese, ned-regulering av kolesterol middelklasseinnbyggere eller en kombinasjon av de ovennevnte faktorene. Monocytter kan også samle lipider i sirkulasjon og har en “skummet” fenotype, muligens disponerer celler for skum celle formasjon^3,4. Skum cellene er de definerende trekk ved fet striper og tidlig stadium aterosklerotisk plaketter og deres dannelse påvirkes av både lipid og inflammatoriske mediatorer⁵. Alternativt, monocytter har evnen til å reversere transmigrate fra arterien i blodet⁶, og dermed fjerne lipid fra intima og fungerende å opprettholde helsen til arterien.

Bestemme tilbøyelighet av monocytter å transmigrate over arteriell endotelet og skjemaet skum celler i intima eller reversere transmigrate og bære lipid av plakk, er viktig for forståelsen av monocyte aktivisering i økende aterosklerotisk risiko. Musen modeller av CADs som atherosclerosis er viktig i Klargjørende sanntid i vivo informasjon med fet strek/aterosklerotisk plakk utvikling. Disse modellene krever imidlertid en genetisk endring av naturlige kolesterol behandling evner av disse dyrene vanligvis kombinert med drastiske endringer i kosthold (for eksempel ApoE-/-Western-type diett modell)^7,8, dermed inducing ikke-fysiologiske akkumulering av sirkulerende lipid nivåer der stasjon plakk utviklingen. Disse modellene kan ha begrenset relevans til kronisk inflammatorisk menneskelige forhold som HIV-infeksjon som ikke er forbundet med økt sirkulerende kolesterol eller lav tetthet lipoprotein (LDL) nivåer. Videre forskjeller i monocytt biologi mellom mennesker og mus gjør testing av immunologiske spørsmål om relevansen av subpopulasjoner av monocytter (som mellomliggende monocytter (CD14⁺⁺CD16⁺))⁹ vanskelig. Dette er viktig når studere mekanismer kjøring kardiovaskulær sykdom som mellomliggende monocytt teller uavhengig forutsi hjerte hendelser^10,11. Mens analyser eksisterer for å måle sekvensielt enten monocytt transmigration eller skum celle formasjon i isolasjon, er ingen i vitro analysen validert for kvantifisering både aspekter av tidlig atherogenesis bruker de samme cellene fra klinisk kohorter. Transwell modeller bruker en modifisert Boyden to-kammer system der celler er lastet inn i toppen kammeret og transmigrate over en porøs plast-barrieren eller celle monolayer i en lavere kammer som vanligvis inneholder medier med chemoattractant^{12 , 13}. mens mye brukt for å analysere leukocytter transmigration, disse modellene ikke generelt inkorporere et lag som representerer intima, noe som resulterer i transmigrated cellene migrerer til løsning, og tillater ikke for måling av skum celle formasjon eller omvendt transmigration til de samme cellene. Derimot gjøre modeller av skum celle formasjon ikke rede for eventuelle transmigratory-indusert endringer monocytter eller effekter av endothelial aktivering som er kjent for å bidra til å skumme celle formasjon¹⁴. Videre disse systemene indusere skum celle formasjon fra makrofager overholdt celle kultur plater med tillegg av Mette konsentrasjoner av eksogene oksidert low-density lipoprotein (oxLDL)^15,16, en nøkkel induser skum celle-formasjonen. LDL brukes i disse modellene er ofte oksidert av ikke-fysiologisk-relevante prosesser som CuSO₄ behandling¹⁷, derfor avhør fysiologiske betydningen av studier med disse modellene.

Her beskriver vi en analyse som quantifies monocytt transmigration og skum celle dannelsen av de samme cellene som ikke krever tillegg av ytre oxLDL, dermed bedre modellering rollen av monocytter i skum celle formasjon. Denne modellen ble opprinnelig utviklet av Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸, og har blitt ytterligere forbedret i vårt laboratorium å vurdere ex vivo atherogenicity av monocytter isolert under ikke-aktivering forhold fra personer med underliggende inflammatoriske tilstander følger sykdommer som HIV infeksjon¹⁹ samt aldring²⁰, som er forbundet med økt risiko for åreforkalkning. Denne modellen gir også en plattform for å svare på grunnleggende biologisk spørsmål om tilbøyelighet av ulike monocytt delsett til skjemaet skum celler²⁰, påvirkning av endothelial aktivering av cytokiner som TNF på skum celle formasjon¹⁴ , og vandrende egenskapene av monocytter som dyp og hastigheten på transmigration i gels¹⁹. Videre monocytt transmigration og skum celle formasjon kan kvantifiseres bruker standard mikroskopi, live celle bildebehandling, flow cytometri og bildebehandling flowcytometri, derfor gir en allsidig metode for å vurdere rollen av monocytter i atherogenesis.