Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Transmigração de monócito é um passo crucial no desenvolvimento da placa de ateroma que pode levar à trombose, derrame e infarto do miocárdio. Ateroma desenvolve de listras gordas, geralmente presentes em locais de fluxo sanguíneo oscilatório baixo em meio às grandes artérias, onde depositada lipídica contribui para ativação endotelial e localizadas inflamação¹. Os monócitos são recrutados para células endoteliais em listras gordas através de proteínas Quimiotáticos de monócitos (tais como CCL2) e transmigrar para o íntima². Após a transmigração, monócitos podem formar macrófagos aterogênico, lipid-laden chamados espuma de células em consequência da absorção de lipídios, síntese de lipídios, para baixo-regulamento de efluxo de colesterol ou uma combinação dos fatores acima. Os monócitos também podem acumular lipídeos na circulação e têm um fenótipo ‘espumoso’, possivelmente predisponentes células de espuma celular formação^3,4. Células de espuma são a característica definidora de listras gordas e estágios iniciais de ateroma e sua formação é influenciada pela lipídico e mediadores inflamatórios⁵. Alternativamente, os monócitos têm a capacidade de reverter transmigrar da artéria para a corrente sanguínea⁶, eliminando lipídico da íntima e agindo para manter a saúde das artérias.

Determinar a propensão dos monócitos para transmigrar através de endotélio arterial e forma as células de espuma em íntima, ou reverter transmigrar e transportar lipídios fora a placa, é um requisito-chave para compreender o papel da ativação de monócitos no aumento risco de aterosclerose. Modelos de mouse de CADs como aterosclerose são importantes na elucidação de informações em tempo real na vivo no desenvolvimento de placa aterosclerótica/raia gordurosos. No entanto, estes modelos requerem uma alteração genética do colesterol natural processamento habilidades destes animais geralmente associada a alterações drásticas na dieta (por exemplo, o modelo de dieta/ApoE-Western-tipo)^7,8, desse modo, induzindo a acumulação não-fisiológica de lipídios em circulação os níveis que desenvolvimento de placa de carro. Estes modelos podem ter limitada relevância para inflamatórias humanas condições crônicas tais como a infecção pelo HIV que não estão associados com aumento níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou colesterol de circulação. Além disso, as diferenças em biologia monócito entre humanos e ratos fazem os testes imunológicos perguntas sobre a relevância de subpopulações de monócitos (tais como intermediários monócitos (CD14 +⁺CD16⁺))⁹ é difícil. Isto é importante quando se estudar os mecanismos de condução doença cardiovascular como contagens de monócitos intermediário independente preveem eventos cardiovasculares^10,11. Enquanto os ensaios existem para medir sequencialmente de qualquer formação monócito transmigração ou espuma de célula isoladamente, sem ensaio em vitro foi validado para quantificar os dois aspectos do atherogenesis início, usando as mesmas células de coortes clínicas. Transwell modelos utilizam um sistema de duas câmaras Boyden modificado pelo qual as células são carregados na câmara superior e transmigrar através de uma barreira de plástico porosa ou monocamada de células em uma câmara inferior que normalmente contém mídia com quimiotático^{12 , 13}. enquanto amplamente utilizado para a análise de transmigração de leucócitos, estes modelos não incorpora geralmente uma camada representando a íntima, resultando em células transmigra migrando em solução e não permitem a medição de célula de espuma formação ou reversa transmigração das mesmas células. Por outro lado, modelos de formação de célula de espuma não representam qualquer alteração induzida por transmigratory monócitos ou efeitos de ativação endotelial, que é conhecido por contribuir para a formação de célula¹⁴de espuma. Além disso, estes sistemas induzem espuma formação de células de macrófagos aderiu às placas de cultura de células através da adição de saturar as concentrações de lipoproteína de baixa densidade oxidada exógenos (RJ)^15,16, um indutor de chave de formação de célula de espuma. LDL usada nestes modelos é muitas vezes oxidado por processos não fisiologicamente-relevantes como CuSO₄ tratamento¹⁷, portanto, questionando a importância fisiológica de estudos usando estes modelos.

Aqui descrevemos um ensaio que quantifica a transmigração de monócitos e formação de célula de espuma das mesmas células que não requer a adição de RJ exógeno, assim, melhor modelagem o papel dos monócitos na formação de células de espuma. Este modelo foi originalmente desenvolvido pelo Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸e foi ainda mais refinado em nosso laboratório para avaliar ex vivo a caracterizações de monócitos isolados sob não-ativação condições de indivíduos com condições inflamatórias subjacentes que acompanham doenças como HIV infecção¹⁹ bem como envelhecimento²⁰, que estão associados com um risco aumentado de aterosclerose. Este modelo também fornece uma plataforma para responder questões biológicas básicas sobre a propensão de subconjuntos diferentes monócito forma espuma células²⁰, a influência da ativação endotelial por citocinas como TNF na formação de célula de espuma¹⁴ e as propriedades migratórias de monócitos, tais como a profundidade e a velocidade de transmigração em géis¹⁹. Além disso, formação de células de transmigração e espuma de monócito pode ser quantificada usando microscopia padrão, vive a imagem latente da pilha, citometria de fluxo imagem e citometria de fluxo, portanto, fornecendo um método versátil para avaliar o papel de monócitos em atherogenesis.