Kvantificering af monocyt Transmigration og skum celle dannelse fra personer med kroniske betændelsestilstande

Monocyt transmigration er et afgørende skridt i udviklingen af aterosklerotiske plak, der kan føre til blodpropper, slagtilfælde og myokardieinfarkt. Aterosklerotiske plaques udvikle fra fede striber, generelt findes på lokaliteter af lav oscillerende blodgennemstrømningen i medium til store arterier, hvor deponerede lipid bidrager til endotel aktivering og lokaliseret betændelse¹. Monocytter rekrutteres i endothelial celler i fede striber via monocyt kemotaktisk proteiner (f.eks CCL2) og transmigrate i intima². Efter transmigration, kan monocytter danne atherogene, lipid-laden makrofager kaldet skum celler som følge af lipid optagelse, lipid syntese, ned-regulering af cholesterol efflux eller en kombination af de ovennævnte faktorer. Monocytter kan også ophobes lipider i omløb og har en ‘skummende’ fænotype, eventuelt disponerende celler for skum celle dannelse^3,4. Skum celler er den definerende funktion af fede striber og tidlige aterosklerotiske plaques og deres dannelse er påvirket af både lipid og inflammatoriske mediatorer⁵. Alternativt, monocytter har evnen til at vende transmigrate fra arterie i blodbanen⁶, derved fjerne lipid fra intima og handler for at bevare sundheden af arterie.

Bestemmelse af tilbøjelighed af monocytter til transmigrate på tværs af arteriel endothelium og danne skum celler i intima, eller at vende transmigrate og bære lipid ud af plak, er en afgørende forudsætning for forståelse af monocyt aktivering i stigende rolle aterosklerotisk risiko. Musemodeller af CADs som åreforkalkning er vigtige i belyse real-time i vivo oplysninger på fede streak/aterosklerotisk plaque udvikling. Disse modeller kræver imidlertid en genetisk ændring af naturlige kolesterol forarbejdning evner af disse dyr, som regel kombineret med drastiske ændringer i kost (såsom ApoE-/-Western-type diæt model)^7,8, dermed, inducerende ikke-fysiologisk ophobning af cirkulerende lipid niveauer som drev plaque udvikling. Disse modeller kan have begrænset relevans for kroniske inflammatoriske menneskelige lidelser såsom HIV-infektion som ikke er forbundet med øget cirkulerer kolesterol eller low-density lipoprotein (LDL) niveauer. Desuden forskelle i monocyt biologi mellem mennesker og mus gør testning af immunologiske spørgsmål om relevansen af delpopulationer af monocytter (såsom mellemliggende monocytter (CD14⁺⁺CD16⁺))⁹ vanskeligt. Dette er vigtigt, når man studerer de mekanismer, der er drivkraften bag hjerte-kar-sygdom som mellemliggende monocyt tæller forudsige uafhængigt kardiovaskulære hændelser^10,11. Mens assays eksisterer for at sekventielt måle enten monocyt transmigration eller skum celle dannelse i isolation, er ingen i vitro assay blevet valideret for kvantificering af begge aspekter af tidlig atherogenesis ved hjælp af de samme celler fra kliniske kohorter. Transwell modeller udnytte en modificeret Boyden to-kammer system, hvorved cellerne er indlæst i det øverste kammer og transmigrate på tværs af en porøs plastbarriere eller celle éncellelag til et andetkammer, der typisk indeholder medier med chemoattractant^{12 , 13}. mens almindeligt anvendt til at analysere leukocyt transmigration, disse modeller ikke generelt optage et lag, der repræsenterer intima, hvilket resulterer i transmigrated celler migrerer til løsning, og tillader ikke for måling af skum celle dannelse eller omvendt transmigration af de samme celler. Omvendt, modeller af skum celle dannelse ikke højde for eventuelle transmigratory-induceret ændringer monocytter eller effekter i endothelial aktivering, som er kendt for at bidrage til at skum celle dannelse¹⁴. Desuden, disse systemer fremkalde skum celle dannelse af makrofager levet op til celle kultur plader ved tilsætning af mætte koncentrationer af eksogene oxideret low-density lipoprotein (oxLDL)^15,16, en nøgle inducer af skum celle dannelse. LDL anvendes i disse modeller er ofte oxideres af ikke-fysiologisk-relevante processer såsom CuSO₄ behandling¹⁷, derfor sætter spørgsmålstegn ved den fysiologiske betydning af studier ved hjælp af disse modeller.

Her beskriver vi en analyse, der kvantificerer monocyt transmigration og skum celle dannelse af de samme celler som ingen kræver tilføjelsen af eksogene oxLDL, dermed bedre modellering af monocytter i skum celle formation rolle. Denne model blev oprindeligt udviklet af Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸, og har været yderligere raffineres i vores laboratorium for at vurdere ex vivo atherogenicity af monocytter isoleret under ikke-aktivering forhold fra enkeltpersoner med underliggende betændelsestilstande ledsagende sygdomme såsom HIV infektion¹⁹ samt aldring²⁰, der er forbundet med en øget risiko for åreforkalkning. Denne model giver også en platform for at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål vedrørende tilbøjelighed af forskellige monocyt delmængder form skum celler²⁰, indflydelse i endothelial aktivering af cytokiner såsom TNF på skum celle dannelse¹⁴ , og de vandrende egenskaber af monocytter som dybden og hastighed af transmigration i geler¹⁹. Derudover monocyt transmigration og skum celle dannelse kan kvantificeres ved hjælp af standard mikroskopi, live celle imaging, flow flowcytometri og imaging flowcytometri, derfor giver en alsidig metode til at vurdere rollen af monocytter i atherogenesis.