Summary

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Published: November 28, 2017
doi:

Summary

Целью настоящего Протокола является возможность для обнаружения в vivo антиген специфические убийство из целевой ячейки в мышиных модели.

Abstract

Текущей методологии антиген специфические убийство ограничены для использования в пробирке или использованы в модели инфекционных заболеваний. Однако это не протокол, специально предназначенные для измерения антиген специфические убийство без инфекции. Этот протокол разработан и описывает методы, чтобы преодолеть эти ограничения, позволяя для обнаружения антиген специфические убийство из целевой ячейки, CD8+ T-клеток в vivo. Это достигается путем слияния с традиционной CFSE-меченых целевого убийства пробирного модель вакцинации. Эта комбинация позволяет исследователю оценить потенциал CTL антиген специфические прямо и быстро, как assay не зависит от роста опухоли или инфекции. Кроме того индикация основана на проточной цитометрии и поэтому должно быть легко доступной для большинства исследователей. Главное ограничение этого исследования является определение timeline в естественных условиях , соответствующий гипотеза тестируется. Вариации численности антигена и мутации в Т-клеток, которые могут привести к дифференциальной цитолитических функции необходимо тщательно оценивать определить оптимальное время для клеток урожай и оценки. Соответствующей концентрации пептидные для вакцинации был оптимизирован для hgp10025-33 и OVA257-264, но потребуются дополнительные проверки для других пептидов, которые могут быть более подходящим для данного исследования. В целом этот протокол позволяет быстро оценки убийстве функции в естественных условиях и может быть адаптирована к любой данной антигена.

Introduction

Множественные протоколы существуют для оценки цитолитических (CTL) потенциал CD8+ или CD4+ Т-клеток. Эта оценка может быть легко сделано в пробирке в контролируемых условиях1,2,3. Кроме того, модели инфекционных заболеваний, таких как LCMV, классически изучили CTL функции с использованием дифференциально CFSE (5-(and 6)-Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира) помечены клетки-мишени где CFSEПривет-помечены клетки пульсирующий с пептида и CFSEЛо-обозначенные цели, клетки остаются unpulsed. Клетки затем вводят в соотношении 1:1 и оценены за потерю CFSEПривет-обозначены потока цитометрии4импульсных цели. Вакцины и неприятие модели также использовали аналогичные стратегии для оценки в vivo убивает обоих CD8+ и CD4 клеток+ T также, как NK клеток5,6. Это мощный пробирного, но требует использования инфекционных агентов, которые премьер иммунной системы до целевой инъекций.

Этот протокол, с другой стороны, требует не ранее инфекция хоста и вместо этого использует стратегию вакцинации премьер иммунной системы до целевой инъекций. Этот вакцинации состоит из водной основе разработки вакцины пептид, который требует предоставления иммуностимулирующее коктейль называется covax7, состоящая из Толл подобный рецептор 7 (TLR7) агонистов (Имиквимод крем), агонистических анти CD40 антитела и интерлейкин-2 (IL-2), ведущих к синергетического сочетание иммуностимулирующее агентов для выхода грунтование пептид конкретных и надежных иммунной реакции. Таким образом этот assay обеспечивает быстрый индикация CTL функции как вакцина осуществляется наряду с клетки для оценки функции только за три дня до инъекции клеток-мишеней. Кроме того covax грунт достаточно сильны, что убийство потенциала загрунтовать антиген специфические Т-клеток можно увидеть между 4 и 24 ч после инъекции.

Главное ограничение этого протокола является определение шкалы времени в естественных условиях для обнаружения целевого убийства, подходящим для антигена и гипотеза тестируется. Внимательны, что оценки должны быть выполнены, как различия в силу антиген, а также генетические изменения испытывается в Т-клеток может привести к дифференциальной функции CTL, которая потребует различных сроков обнаружения целевого убийства. Кроме того, в то время как соответствующие концентрация пептидный для вакцинации был оптимизирован для человека меланомы антигена гликопептидных 100 (hgp10025-33) и овальбумина257-264 (OVA257-264)8,9 , использование другого антиген модель, которая может быть более подходящим для данного исследования потребует дальнейшей проверки. Из-за ожидаемых различий в целевой антигены способность стимулировать CTL эффекторные функции в сочетании с covax как вспомогательное средство оптимизация IL-2 дозе концентрации дозы и частоты может быть необходимо для достижения желаемой цели. В целом этот протокол позволяет для быстрой оценки убийстве функции в естественных условиях и может быть адаптирована к любой данной антигена.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Техаса MD Anderson Cancer Center. 1. Подготовка пептида вакцины Распустить лиофилизированные пептид с фосфат амортизированное saline (PBS) для соответствующей ко…

Representative Results

До инъекции клеток-мишеней, помечены CFSE смесь 1:1 ячейка запускается на проточный цитометр для определения базовой частоты CFSEПривет и CFSEЛо клеток-мишеней. Рисунок 1 A показывает стробирования стратегии для обнаружения изменений в п?…

Discussion

Хотя этот протокол является простым, есть несколько важных шагов, которые должны тщательно выполняться. Covax грунтовка, после инъекции антиген специфические Т-клеток проходит проверку необходимо увидеть любые убийства импульсного целей. Хотя вполне возможно, что на водной основе covax ва?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается низ исследования (A1R03AI120027 (RN) и 1R21AI20012 (RN)), Грант институциональных исследований (RN), начальный Грант (RN) и MD Андерсон CIC семенного предоставлении (RN).

Materials

6- to 12-week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12-week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

Referencias

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

Play Video

Citar este artículo
Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

View Video