Summary

Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica

Published: November 12, 2017
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Summary

A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.

Abstract

A retina humana é composta da neuroretina sensorial e o epitélio pigmentado da retina subjacente (RPE), que é complexado com firmeza à camada vascular da coroide. Diferentes regiões da retina são anatomicamente e molecularmente distintas, facilitando as funções originais e demonstrando o diferencial susceptibilidade à doença. Análise proteômica de cada uma destas regiões e camadas pode fornecer insights vitais sobre o processo molecular de muitas doenças, incluindo Age-Related Degeneração Macular (AMD), diabetes mellitus e glaucoma. No entanto, separação de camadas e regiões da retina é essencial antes de análise proteômica quantitativa pode ser realizado. Aqui, descrevemos um método para dissecção e coleção de regiões da retina central, periféricas e maculares e subjacentes RPE coroide complexo, envolvendo regional soco biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano. Unidimensional de SDS-PAGE, bem como análise de proteomic a jusante, tais como líquida espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS), pode ser usado para identificar proteínas em cada camada da retina dissecada, revelando moleculares biomarcadores para doenças da retina.

Introduction

A retina, RPE e coroide são tecidos complexos que demonstram diferenças regionais importantes na expressão de proteínas, função fisiológica e patológica suscetibilidades1,2. Por exemplo, doenças como a Degeneração Macular Age-Related (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia serosa central cada demonstram característica localização dentro da fóvea, mácula ou retina periferia1,3, 4,6. Aqui, apresentamos um método demonstrando como distinta da retina regiões podem ser degustadas de forma independente. O objetivo geral deste método é fornecer um guia confiável para coleta de amostras de tecido da região macular, Central e periférica da retina humana e RPE coroide para análise proteômica. A justificativa para o desenvolvimento e a utilização desta técnica é que através da análise de proteomic destas regiões específicas da retina, importante introspecções moleculares podem ser adquiridas para as funções fisiológicas e fisiopatológicas destas regiões.

Esta abordagem promete revelar a base de proteomic para suscetibilidades doença regional relativo e para facilitar a identificação de novos alvos terapêuticos específicos. Com efeito, proteomic investigações sobre o vítreo e suas interações com a retina forneceu insights-chave na composição molecular e função dos tecidos saudáveis e doentes5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, análises de proteomic nítida de distintas regiões da retina são escassos. A técnica vai ajudar a apoiar estes estudos muito necessária, proporcionando vantagens sobre outros métodos demonstrando uma abordagem de coleta de tecido confiável e reprodutível. Mais ainda, a abordagem é muito acessível, aproveitando-se do ponche de tecido tamanho padrão e prontamente disponíveis a ferramentas de biópsia. Nossa técnica enfatiza a recolha e armazenamento de tecidos para proteomic processamento, fazendo considerações importantes para a estabilidade da proteína e degradação. Assim, este método é mais adequado para os investigadores a jusante análise molecular de proteomic factores a considerar.

Protocol

este estudo foi aprovado pela Universidade de Iowa ' s Conselho de revisão institucional e adere aos princípios estabelecidos na declaração de Helsinque. 1. Foveal e Macular soco biópsia aberto e borboleta olho humano, que consiste em 4 diferentes retalhos de tecido, conforme descrito em uma publicação anterior. 5 começando com um borboleta olho humano colocado em uma placa de Petri, centralize uma ferramenta de biópsia do perfurador d…

Representative Results

Tecido de RPE coroide e da retina podem ser processadas de várias maneiras, de acordo com uma investigação individual. Após a coleta, o pesquisador possuirá amostras da retina e RPE coroide tecido da região central, exterior mácula e retina periférica (Figura 1). Especificamente, o soco de região central incluirá a fóvea, o parafovea e uma pequena quantidade do perifovea adjacente. O soco macular inclui o restante da região perifoveal, bem como um…

Discussion

Depois de tecido recolha, manipulação de amostra e tratamento são cruciais considerações14. Preservação em nitrogênio líquido é preferida por fixação química, como o último pode resultar em danos à estrutura da proteína, que pode distorcer a análise a jusante. Além disso, a preservação de nitrogênio líquido é preferencial para métodos que não envolvem o congelamento de amostras. Notavelmente, Ferrer et al mostraram diferenças significativas nos níveis de proteí…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VBM é suportada por concessões de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 e pesquisa para evitar cegueira (RPB), New York, NY. MT e GV são suportados pelo NIH conceder T32GM007337.

Materials

4-mm skin punch biopsy tool Miltex REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool Miltex REF 33-37
0.12 Colibri Forceps Stephens Instruments S5-1145
Wescott Scissors Sklar Surgical Instruments 64-3146
Microfuge tubes Eppendorf #022364111 1.5 mL
Liquid Nitrogen Praxair, Inc. 7727-37-9 [R]

Referencias

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Citar este artículo
Cabral, T., Toral, M. A., Velez, G., DiCarlo, J. E., Gore, A. M., Mahajan, M., Tsang, S. H., Bassuk, A. G., Mahajan, V. B. Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (129), e56203, doi:10.3791/56203 (2017).

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