Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Sias são açúcares ácidos que cobrem as cadeias de glicano nas glicoproteínas de superfície celular e glicolípidos em vertebrados. A expressão de Sia é modificada em células cancerosas ¹ e correlaciona-se com progressão e / ou metástase ^{2 , 3} . Duas das principais formas Sia em mamíferos são Neu5Ac e sua forma hidroxilada, Neu5Gc ² . Os seres humanos não podem sintetizar Neu5Gc devido a uma inativação específica do gene que codifica a enzima CMAH. Este Sia não-humano incorpora metabólicamente em células humanas como "auto", provenientes de alimentos ricos em minerais Neu5Gc ( por exemplo, carne vermelha) ^{4 , 5} . Neu5Gc está presente em níveis baixos nas superfícies celulares do epitélio humano e do endotélio, mas especialmente se acumula em carcinomas. Neu5Gc é reconhecido como estrangeiro pelo sistema imunológico humoral humano ^{2 , 6} .A complexidade antigênica de Neu5Gc-glycan pode surgir em vários níveis, incluindo modificação de Neu5Gc, ligação, glicanos subjacentes e andaimes e sua densidade, tudo refletido pela complexidade da resposta de anticorpos anti-Neu5Gc em seres humanos ⁶ . Alguns desses anticorpos servem como biomarcadores de carcinoma e potencial imunoterapêuticos ⁷ . O advento da síntese quimiomenzima de diferentes sialoglicanos ⁸ abriu caminho para a análise mais aprofundada de tais anticorpos, facilitada pelo uso de tecnologia de microarray de glicano ^{9 , 10} . Assim, com a preparação e manipulação facilitadas de grandes bibliotecas de carboidratos naturais e sintéticos, as microarrays de glicano tornaram-se uma poderosa tecnologia de alto débito para investigar as interações de carboidratos com uma miríade de biomoléculas ^{10 , 11 ,} </sup> ^{12 , 13} . Em um formato de matriz, são utilizadas quantidades mínimas de materiais e esta exibição multivalente de glicanos biologicamente relevantes permite a investigação de milhares de interações de ligação em um único experimento. Importante, esta tecnologia também pode ser aplicada à descoberta de biomarcadores e ao monitoramento de respostas imunes em várias amostras ^{7 , 12} .

A fabricação bem-sucedida de microarray de glicano requer a consideração de três aspectos importantes: o tipo de robô de impressora, química de conjugação de glicano e ótica de detecção. Quanto à consideração do instrumento de impressão, duas técnicas estão disponíveis: impressoras de contato e sem contato. Em impressão de contato, os pinos de aço 1-48 são mergulhados em uma placa de fonte de vários poços contendo solução de glicano e são manchados em lâminas de vidro funcionalizadas, contactando diretamente a superfície deslizante de vidro. A quantidade da solução é deO fator do slide é uma função da duração persistente na superfície deslizante. Geralmente, as amostras são primeiro pré-manchadas em um bloco de vidro (para alcançar manchas homogêneas) antes de serem impressas na superfície deslizante. Em impressoras sem contato ( por exemplo, a impressora piezoelétrica), os glicanos são impressos a partir de um capilar de vidro usando sinais elétricos controlados. O sinal elétrico pode ser finamente calibrado para obter uma impressão mais precisa em relação à impressão de contato. O tamanho e a morfologia das manchas também são relativamente mais homogêneas. Uma vantagem adicional é a reciclagem da amostra de volta para a placa de origem após a impressão. No entanto, a principal desvantagem das impressoras piezoelétricas é a limitação da tipagem de impressão (4 ou 8), resultando em uma duração de impressão muito longa, o que requer atenção especial para a estabilidade do slide, a temperatura, a umidade e a evaporação da amostra. A impressora a jato de tinta sem contato requer volumes de amostra maiores ¹⁴ .

<p class = "jove_content"> Em contraste com as opções disponíveis limitadas para métodos de impressão, a química de conjugação de glicano é uma consideração mais complexa, com muitas opções para escolher. A química de imobilização selecionada deve explicar os grupos ativos nos glicanos e a reatividade da superfície deslizante. Os glicanos a serem imobilizados sobre uma superfície de microarrays específica, sinteticamente sintetizada ou naturalmente isolada, exigem um grupo reativo idêntico. Além disso, os glicanos precisam ser puros e homogêneos. Por outro lado, a superfície de imobilização e a química devem proporcionar reprodutibilidade e densidade de ligação confiável. Múltiplos métodos de imobilização foram desenvolvidos com a inclusão covalente ou não covalente (absorção física) ^{10 , 11 , 12 , 13} . Para obter informações altamente detalhadas sobre a tecnologia impressa de microarray de glicano para os não iniciadosInvestigador, consulte estas excelentes críticas ^{13 , 15} . Importante, as informações mínimas recentes exigidas para uma iniciativa Glycomics Experiment (MIRAGE) descrevem diretrizes para a preparação de amostras ¹⁶ e para relatar dados de análises de microarrays de glicanos ¹⁷ para melhorar os padrões neste campo em crescimento.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a fabricação de microarrays de sialoglicano usando uma nano-impressora de contato específico em um formato de 16 poços. Cada um dos glicanos possui uma amina primária que medeia a sua ligação covalente para lâminas de vidro activadas com epóxi. Também descrevemos o desenvolvimento e a análise de um slide usando várias amostras de soros humanos, anticorpos e lectinas de plantas vinculativas de Sia. Os ensaios de microarrays de Sialoglycan envolvem várias etapas principais que incluem fabricação, processamento, desenvolvimento e análise de matrizes. A fabricação de matrizes exige planejar o arLayout de raios, preparando os glicanos e a placa fonte, programando a nano-impressora e imprimindo as lâminas. Posteriormente, os slides são processados, desenvolvidos e analisados ​​( Figura 1 ).