Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

Sias sind saure Zucker, die Glykinketten auf Zelloberflächen-Glykoproteinen und Glykolipiden bei Wirbeltieren abdecken. Sia-Expression wird in Krebszellen ¹ modifiziert und korreliert mit Progression und / oder Metastase ^{2 , 3} . Zwei der großen Sia-Formen bei Säugetieren sind Neu5Ac und seine hydroxylierte Form, Neu5Gc ² . Menschen können Neu5Gc aufgrund einer spezifischen Inaktivierung des für das CMAH-Enzym kodierenden Gens nicht synthetisieren. Diese nicht-menschliche Sia enthält metabolisch in menschliche Zellen als "Selbst", die aus diätetischen Neu5Gc-reichen Nahrungsmitteln ( zB rotem Fleisch) ^{4 , 5 stammen} . Neu5Gc ist bei niedrigen Niveaus auf den Zelloberflächen von menschlichen Epithelien und Endothelien vorhanden, aber es sammelt sich besonders bei Karzinomen an. Neu5Gc wird vom humanen humoralen Immunsystem ^{2 , 6} als fremd anerkannt.Die antigene Komplexität von Neu5Gc-Glykane können auf mehreren Ebenen entstehen, einschließlich Neu5Gc Modifikation, Verknüpfung, zugrunde liegenden Glykane und Gerüste, und ihre Dichte, alle reflektiert durch die Komplexität der anti-Neu5Gc Antikörperantwort beim Menschen ^6. Einige dieser Antikörper dienen als Karzinom-Biomarker und potenzielle Immuntherapeutika ⁷ . Das Aufkommen der chemoenzymatischen Synthese verschiedener Sialoglycane ⁸ ebnete den Weg für eine eingehendere Analyse solcher Antikörper, erleichtert durch den Einsatz der Glycan-Microarray-Technologie ^{9 , 10} . So sind mit der erleichterten Vorbereitung und Manipulation von großen Bibliotheken von natürlichen und synthetischen Kohlenhydraten Glycan-Mikroarrays zu einer leistungsfähigen Hochdurchsatz-Technologie geworden, um die Wechselwirkungen von Kohlenhydraten mit einer Vielzahl von Biomolekülen ^{10 , 11 ,} </sup> ^{12 , 13} In einem Array-Format werden minimale Mengen an Materialien verwendet, und diese multivalente Anzeige von biologisch relevanten Glykanen ermöglicht die Untersuchung von Tausenden von Bindungsinteraktionen in einem einzigen Experiment. Wichtig ist, dass diese Technologie auch auf die Biomarker-Entdeckung und die Überwachung von Immunantworten in verschiedenen Proben angewendet werden kann ^{7 , 12} .

Die erfolgreiche Glycan-Microarray-Herstellung erfordert die Berücksichtigung von drei wichtigen Aspekten: der Roboter-Typ, die Glycan-Konjugationschemie und die Detektionsoptik. Für die Druckinstrumentenbetrachtung stehen zwei Techniken zur Verfügung: Kontakt- und berührungslose Drucker. Im Kontaktdruck werden 1-48 Stahlstifte in eine Multi-Well-Quellplatte mit Glycan-Lösung getaucht und auf funktionalisierten Glasrutschen durch direktes Kontaktieren der Glas-Gleitfläche entdeckt. Die Lösungsmenge deAn die Folie geleitet wird, ist eine Funktion der anhaltenden Dauer auf der Gleitfläche. Normalerweise werden die Proben zuerst auf einem Glasblock vorgespannt (um homogene Flecken zu erreichen), bevor sie auf die Gleitfläche gedruckt werden. Bei berührungslosen Druckern ( z. B. dem piezoelektrischen Drucker) werden die Glykane aus einer Glaskapillare mit kontrollierten elektrischen Signalen bedruckt. Das elektrische Signal kann fein kalibriert werden, um ein präziseres Drucken im Verhältnis zum Kontaktdruck zu erreichen. Die Größe und Morphologie der Flecken sind auch relativ homogener. Ein zusätzlicher Vorteil ist das Recycling der Probe nach dem Druck auf die Quellplatte. Trotzdem ist der Hauptnachteil von piezoelektrischen Druckern die Druckspitzenbegrenzung (4 oder 8), was zu einer sehr langen Druckdauer führt, die besondere Aufmerksamkeit auf Gleitstabilität, Temperatur, Feuchtigkeit und Probenverdampfung erfordert. Der berührungslose Tintenstrahldrucker benötigt größere Probenvolumina ¹⁴ .

<p class = "jove_content"> Im Gegensatz zu den begrenzten verfügbaren Optionen für Druckmethoden ist die Glycan-Konjugationschemie eine komplexere Betrachtung, mit vielen Möglichkeiten zur Auswahl. Ausgewählte Immobilisierungschemie muss sowohl die aktiven Gruppen auf den Glykanen als auch die Schieberoberflächenreaktivität berücksichtigen. Die Glycane, die auf einer bestimmten Mikroarray-Oberfläche immobilisiert werden sollen, entweder synthetisch synthetisiert oder natürlich isoliert, benötigen alle eine identische reaktive Gruppe. Darüber hinaus müssen die Glykane rein und homogen sein. Auf der anderen Seite sollte die Immobilisierungsoberfläche und die Chemie Reproduzierbarkeit und zuverlässige Befestigungsdichte bieten. Mehrere Immobilisierungsmethoden wurden mit entweder kovalenten oder nicht-kovalenten (physikalischen Absorptions-) Bindungen ^{10 , 11 , 12 , 13 entwickelt} . Für detaillierte Informationen über gedruckte Glycan-Microarray-Technologie für die UninitiativeD Ermittler, beziehen sich auf diese ausgezeichneten Bewertungen ^{13 , 15} . Wichtig ist, dass die jüngsten Mindestinformationen für eine Glycomics Experiment (MIRAGE) Initiative Leitlinien für die Probenvorbereitung ¹⁶ und für die Meldung von Daten aus Glycan-Microarray-Analysen ¹⁷ zur Verbesserung der Standards in diesem wachsenden Bereich beschrieben werden.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Sialoglycan-Mikroarrays mit einem speziellen Kontakt-Nano-Drucker im 16-Well-Format. Jeder der Glycane hat ein primäres Amin, das ihre kovalente Verbindung zu epoxyaktivierten Glasrutschen vermittelt. Wir beschreiben auch die Entwicklung und Analyse einer Folie mit verschiedenen menschlichen Serenproben, Antikörpern und Sia-bindenden Pflanzenlektinen. Sialoglycan Microarray-Assays beinhalten mehrere wichtige Schritte, die Array-Herstellung, Verarbeitung, Entwicklung und Analyse beinhalten. Array-Fertigung erfordert die Planung der arRay-Layout, Vorbereitung der Glykane und Quellplatte, Programmierung der Nano-Drucker, und das Drucken der Folien. Anschließend werden die Folien verarbeitet, entwickelt und analysiert ( Abbildung 1 ).