Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie voor ernstige depressie. ECS stimuleert wereldwijd activiteit in de hippocampus, wat leidt tot synaptogenese en synaptische plasticiteit. Hier beschrijven we methoden voor ECS inductie bij ratten en voor subcellular versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in synaptic eiwitten.
Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie, de meest effectieve behandeling voor ernstige depressie. ECS induceert gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen met lage sterfte en neuronale dood en is een veel gebruikte model tot scherm anti-epileptische geneesmiddelen. Hier beschrijven we een ECS inductie methode in die een korte 55-mA stroom wordt geleverd voor 0,5 s aan mannelijke ratten 200-250 g in gewicht via oor-clip elektroden. Dergelijke bilaterale stimulatie geproduceerd etappe 4-5 klonische aanvallen die duurde ongeveer 10 s. Na de stopzetting van acute of chronische ECS sham meeste ratten hersteld te gedragsgestoorde niet te onderscheiden van “geen aanvallen” ratten. Omdat ECS wereldwijd hersenactiviteit verheft, heeft het ook te onderzoeken activiteit-afhankelijke wijzigingen van synaptic eiwitten en hun gevolgen voor synaptic kracht met behulp van meerdere methoden gebruikt. Subcellular versplintering van het postsynaptisch dichtheid (PSD) in combinatie met het westelijke bevlekken voorziet met name in de kwantitatieve bepaling van de overvloed aan synaptic eiwitten op deze gespecialiseerde synaptic structuur. In tegenstelling tot een vorige fractionering methode waarvoor grote hoeveelheid knaagdier hersenen, beschrijven we hier een kleinschalige fractionering methode om te isoleren van de PSD van de hippocampi van een enkele rat, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren. Met behulp van deze methode, laten we zien dat de geïsoleerde PSD breuk postsynaptisch membraaneiwitten bevat, met inbegrip van PSD95, GluN2B en GluA2. Synaptophysin van de presynaptische marker en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline werden uitgesloten van de PSD-breuk, tonen van succesvolle PSD isolatie. Bovendien daalde chronische ECS GluN2B expressie in de PSD, waaruit blijkt dat onze kleinschalige PSD fractionering methode kan worden toegepast om de opsporing van de wijzigingen in hippocampal PSD eiwitten uit een enkele rat na genetische, farmacologische of mechanische behandelingen .
Elektroconvulsieve therapie is gebruikt voor de behandeling van patiënten met grote depressieve stoornissen, met inbegrip van ernstige resistente depressie, bipolaire depressie, Parkinson ziekten en schizofrenie1,2. In deze therapie, wordt inbeslagneming gegenereerd door elektrische prikkel geleverd aan het hoofd van narcose patiënten via epicranial elektroden,1,,2,3. Herhaalde toediening van ECS is klinisch gunstig voor resistente depressieve stoornissen1,2,3. Het exacte mechanisme dat ten grondslag ligt aan de lange termijn effectiviteit van het antidepressivum effect bij de mens is echter gebleven ongrijpbaar. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie en wordt veel gebruikt om te onderzoeken zijn therapeutische mechanisme. Bij knaagdieren, zowel acute ECS en chronische ECS behandeling bevorderen van volwassen neurogenesis in het hippocampi en reorganiseren van het neuraal netwerk4,5, die waarschijnlijk zullen bijdragen tot verbeteringen in cognitieve flexibiliteit is. Bovendien, global hoogte van hersenactiviteit door ECS verandert de overvloed van afschriften, zoals een hersenen afgeleide neurotrope factor6en meerdere eiwitten, met inbegrip van metabotropic glutamaat-receptor 17 en de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) type glutamaat receptor subeenheden7. Deze wijzigingen zijn betrokken bij het bemiddelen van langdurige wijziging van SYNAPS nummer, structuur en sterkte in de hippocampus7,8,9.
In ECS modellen, wordt elektrische stimulatie bezorgd bij knaagdieren via stereotaxically geïmplanteerde elektroden, hoornvlies elektroden of oor elektroden te roepen gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen10,11. Stereotaxic implantatie van elektroden hersenoperatie impliceert en vereist heel wat tijd aan het verbeteren van de experimentator chirurgische vaardigheden om te minimaliseren van de schade. Minder invasieve hoornvlies elektroden kon veroorzaken hoornvlies schuren en droogheid en anesthesie nodig. Het gebruik van oor-clip elektroden omzeilt deze beperkingen, omdat ze kunnen worden gebruikt op knaagdieren zonder chirurgie of anesthesie en minimale schade veroorzaken. Inderdaad, vonden we dat huidige geleverde te wakker ratten via de elektroden van de oor-clip betrouwbaar induceert stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen en verandert van synaptic eiwitten in hun hippocampi10.
Om te onderzoeken de ECS-geïnduceerde overvloed van synaptic eiwitten in de specifieke hersengebieden van de knaagdieren, is het belangrijk om te kiezen van de experimentele methoden die meest geschikt voor de detectie en kwantificering zijn. Subcellular versplintering van de hersenen zorgt voor de ruwe isolatie van oplosbare cytosolische proteïnen; membraaneiwitten; organel-grenzen eiwitten; en zelfs eiwitten in speciale subcellular structuren, zoals de PSD-12,13,14. De PSD is een compact en overzichtelijk subcellular domein in neuronen waarin synaptic eiwitten sterk geconcentreerd op en in de buurt van het postsynaptisch membraan12,13,15 zijn. Het isolement van de PSD is handig voor de studie van synaptic eiwitten verrijkt op de PSD, sinds dynamische veranderingen in de omvang en de functie van postsynaptisch glutamaat receptoren, steigers eiwitten en signaaltransductie eiwitten in de PSD-12 , 15 , 16 , 17 zijn gecorreleerd met synaptische plasticiteit en de synaptopathy waargenomen in diverse neurologische aandoeningen17,18. Een vorige subcellular fractionering methode gebruikt voor het zuiveren van de PSD betrokken het isolement van de breuk wasmiddel onoplosbare uit de ruwe membraan van de hersenen door de differentiële centrifugeren van sacharose verlopen14, 19. de grote uitdaging met deze traditionele methode is dat er grote hoeveelheden knaagdieren brains14,19. Voorbereiding van 10-20 knaagdieren te isoleren van de Fractie van de PSD per behandeling vereist uitgebreide kosten en tijdsinvestering en is niet praktisch haalbaar als er vele behandelingen zijn.
Om te overwinnen deze uitdaging, hebben we een eenvoudiger methode die rechtstreeks isoleert van de PSD-breuk, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren20,21, en herzien om te gelden voor PSD isolatie van de hippocampi van een enkele rat aangepast hersenen. Onze kleinschalige PSD fractionering methode levert over 30-50 µg van de PSD-eiwitten uit 2 hippocampi, voldoende voor gebruik in verschillende biochemische tests, met inbegrip van immunoprecipitation en westelijke bevlekken. Westelijke bevlekken toont het succes van onze methode voor het isoleren van de richtlijn betalingsdiensten door te onthullen een verrijking van het postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD-95) en de uitsluiting van de presynaptische marker synaptophysin en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline. Onze ECS inductie en kleinschalige PSD fractionering methoden zijn gemakkelijk aan te passen aan andere knaagdieren hersengebieden en bieden een relatief eenvoudige en betrouwbare manier om te evalueren van de effecten van ECS op de expressie van PSD eiwitten.
Hier beschrijven we een ECS inductie methode bij ratten die de globale stimulatie van neuronale activiteit in hun hippocampi lokt. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie, die klinisch wordt gebruikt voor de behandeling van drug vuurvaste depressieve stoornissen in mensen1,2,3. Ondanks gebruik van elektroconvulsieve therapie voor de behandeling van ernstige depressie, is de precieze onderliggende mechanisme ond…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken dat Dr. Eric C. Bolton te gebruiken zijn centrifuge voor fractionering en Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir lab aan de John Hopkins University voor het verstrekken van ons met het kleinschalige protocol voor de PSD fractionering.
Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
Name of Antibody | |||
PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |