Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas

Eletroconvulsoterapia tem sido usada para tratar pacientes com distúrbios depressivos major, incluindo depressão severa resistente a medicamentos, depressão bipolar, a doença de Parkinson doenças e esquizofrenia^1,2. Esta terapia, convulsão é gerado pelo estímulo eléctrico entregado na cabeça de pacientes anestesiados através de sub-fascial eletrodos^1,2,3. Administração repetitiva de ECS tem sido clinicamente benéfica para transtornos depressivos resistentes^1,2,3. No entanto, o mecanismo exato subjacentes a eficácia a longo prazo do efeito antidepressivo em humanos permaneceu indescritível. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia e é amplamente usado para investigar seu mecanismo terapêutico. Em roedores, ambos ECS aguda e crônico tratamento ECS promovem neurogénese adulta no hipocampo em reorganizar a rede neural^4,5, susceptível de contribuir para melhorias na flexibilidade cognitiva. Além disso, elevação global da atividade cerebral por ECS altera a abundância de transcrições, tais como um cérebro derivada neurotrópica fator⁶e várias proteínas, incluindo metabotrópico glutamato receptor 1⁷ e o N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades⁷. Estas mudanças estão envolvidas na mediação a longo prazo modificação do número de sinapse, estrutura e força do hipocampo^7,8,9.

Modelos ECS, estimulação elétrica é entregue para roedores via stereotaxically implantados eletrodos, eletrodos corneais ou eletrodos de orelha para evocar as convulsões tônico-clônica generalizada^10,11. Estereotáxica implante de eletrodos envolve cirurgia cerebral e exige um tempo significativo para melhorar habilidades cirúrgicas do experimentador para minimizar a lesão. Menos invasivos eletrodos corneais podem causar secura e abrasão corneal e requer anestesia. O uso de eletrodos de orelha-clip ignora essas limitações porque eles podem ser usados em roedores sem cirurgia ou anestesia e causam lesão mínima. De fato, descobrimos que atual entregues ao acordado ratos através de orelha-clip eletrodos confiantemente induz convulsões tônico-clônicas fase 4-5 e altera as proteínas sinápticas em seu hipocampo¹⁰.

Para examinar a abundância de ECS-induzida de proteínas sinápticas em regiões específicas do cérebro dos roedores, é importante escolher os métodos experimentais que são mais adequados para a sua detecção e quantificação. Fraccionamento subcelular do cérebro permite o isolamento bruto de proteínas citosólico solúveis; proteínas de membrana; proteínas de organela-limites; e até mesmo proteínas em estruturas subcelulares especiais, tais como o PSD^12,13,14. O PSD é um domínio subcellular denso e bem organizado em neurônios no qual proteínas sinápticas são altamente concentradas em e perto da membrana pós-sináptica^12,13,15. O isolamento do PSD é útil para o estudo de proteínas sinápticas enriquecido no PSD, desde mudanças dinâmicas na abundância e função de receptores pós-sinápticos glutamato, andaimes proteínas e proteínas de transdução de sinal no PSD^{12 , 15 , 16 , 17} são correlacionadas com plasticidade sináptica e o synaptopathy observado em várias doenças neurológicas^17,18. Um método de fracionamento subcelular anterior usado para purificar o PSD envolveu o isolamento da fração insolúvel em detergente da fracção bruto da membrana do cérebro pela centrifugação diferencial de gradientes de sacarose^{14, 19}. o grande desafio com esse método tradicional é que ele requer grandes quantidades de roedores cérebros^14,19. Preparação de 10-20 roedores para isolar a fração do PSD por tratamento exige extensivo custo e investimento de tempo e não é praticamente viável se existem muitos tratamentos.

Para superar este desafio, nós adaptamos um método mais simples que diretamente isola a fração do PSD, sem sacarose centrifugação gradiente^20,21e revisto para ser aplicável ao isolamento do PSD do hipocampo de rato único cérebro. Nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala produz sobre 30-50 µ g de proteínas PSD de 2 hipocampo, suficiente para o uso em vários ensaios bioquímicos, incluindo imunoprecipitação e mancha ocidental. Mancha ocidental demonstra o sucesso do nosso método para isolar o PSD, revelando o enriquecimento da proteína densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) e a exclusão de marcador pré-sináptica Sinaptofisina e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina. Nossa indução ECS e métodos de fracionamento de PSD em pequena escala são facilmente adaptáveis para outras regiões do cérebro de roedor e fornecem uma maneira relativamente simples e confiável para avaliar os efeitos da ECS na expressão de proteínas do PSD.