Sporing av DNA-fragmenter i sanntid etter Smartphone
Summary
Tradisjonelle slabelelektroforeseeksperimenter (SGE) -forsøk krever et komplisert apparat og høyt kjemisk forbruk. Dette arbeidet presenterer en protokoll som beskriver en billig metode for å skille DNA-fragmenter innenfor en kort tidsramme.
Abstract
Slabelelektroforese (SGE) er den vanligste metoden for separering av DNA-fragmenter; Dermed er det stort sett brukt på feltet av biologi og andre. Den tradisjonelle SGE-protokollen er imidlertid ganske kjedelig, og forsøket tar lang tid. Dessuten er det kjemiske forbruket i SGE-eksperimenter svært høyt. Dette arbeidet foreslår en enkel metode for separering av DNA-fragmenter basert på en SGE-brikke. Brikken er laget av en graveringsmaskin. To plastplater brukes til eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til det optiske signalet. Fluorescenssignalet til DNA-båndene oppsamles av smarttelefonen. For å validere denne metoden ble 50, 100 og 1000 bp DNA-stiger separert. Resultatene viser at en DNA-stige mindre enn 5000 bp kan løses innen 12 minutter og med høy oppløsning ved bruk av denne metoden, noe som indikerer at det er en ideell erstatning for den tradisjonelle SGE-metoden.
Introduction
Slabelelektroforese (SGE) er den mest effektive metoden for DNA-fragment separasjon 1 , 2 , 3 , 4 , 5 og er derfor ansett som et allsidig verktøy i biokjemiske og biologiske analyser 6 , 7 , 8 . Mange eksperimenter indikerer imidlertid at SGE er begrenset av følgende fire problemer: (1) separasjonene tar mange timer og til og med dager; (2) det kjemiske forbruket er svært høyt; (3) det krever et komplisert apparat ( f.eks. 2D elektroforese celle, elektroforese strømforsyning og gel bildebehandling system); (4) gelbildesystemet kan bare observere de separerte DNA-fragmentene når forsøket er ferdig. Videre er etidiumbromid (EtBr), som vanligvis brukes i SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, er mutagent og kreftogen 11 , 12 . Hansker bør derfor alltid brukes når de gir geler som inneholder EtBr.
Kapillærelektroforese (CE) har mange fordeler 13 , 14 , 15 , 16 , 17 sammenlignet med SGE, som automatisk drift, kort separasjonstid og lavere forbruk. Men CE-instrumentet er ganske dyrt. For å overvinne disse begrensningene er det derfor utviklet et system ( Figur 1 ) for separasjon av DNA. Et slikt system kan ikke bare sterkt redusere det kjemiske forbruket og spare på SGE-eksperimentet (<8 min), men det kan også utføre sanntidssporing av DNA-separasjonsprosessen i agarosegelen ved hjelp av smarttelefonen. Ved å følge prosedyrene beskrevet i denne protokollen, skal studenteneJeg kan designe og lage SGE-brikken, lage agarosegelen i brikken, sette opp et enkelt SGE-system med en smarttelefon og registrere DNA-migrasjonsprosessen i agarosegelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Agarosegelelektroforese er i stor grad benyttet for separasjon av DNA, RNA og protein. Dette arbeidet foreslår en ny metode for å erstatte den tradisjonelle gelelektroforeseprotokollen. Resultatene viser at 50, 100 og 1000 bp DNA-stiger kan separeres godt i en så liten, samlet enhet. Den store fordelen med denne metoden er at den ikke bare kan skille nukleinsyrene med lite kjemisk forbruk, men det kan også registrere separasjonsprosessen. Selv om DNA-fragmentene ser bredt ut i figur 2 ,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner takknemlig støtte fra National Natural Science Foundation of China (21205078) og Forskningsfondet for doktorgradsprogrammet for høyere utdanning i Kina (No.20123120110002). Dette arbeidet ble delvis støttet av Kinas nasjonale nøkkelforsknings- og utviklingsprogram (2016YFB1102303), Kinas nasjonale grunnforskningsprogram (973Program; 2015CB352001) og Nasjonalt naturvitenskapelig fundament i Kina (61378060).
Materials
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 |
| 50bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A |
| 100bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A |
| 1kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
Referencias
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
