Sporing af DNA-fragmenter i realtid af Smartphone
Summary
Traditionelle slabelelektroforese (SGE) eksperimenter kræver et kompliceret apparat og et højt kemisk forbrug. Dette arbejde præsenterer en protokol, der beskriver en billig metode til at adskille DNA-fragmenter inden for en kort tidsramme.
Abstract
Slabelelektroforese (SGE) er den mest almindelige metode til separering af DNA-fragmenter; Det er således bredt anvendt til biologi og andre. Den traditionelle SGE-protokol er dog ret kedelig, og eksperimentet tager lang tid. Desuden er det kemiske forbrug i SGE-forsøg meget højt. Dette arbejde foreslår en simpel metode til adskillelse af DNA-fragmenter baseret på en SGE-chip. Chippen er lavet af en gravemaskine. To plastikplader anvendes til excitations- og emissionsbølgelængderne af det optiske signal. Fluorescenssignalet fra DNA-båndene opsamles af smartphone. For at validere denne metode blev 50, 100 og 1000 bp DNA-stiger adskilt. Resultaterne viser, at en DNA-stige mindre end 5.000 bp kan løses inden for 12 minutter og med høj opløsning ved brug af denne metode, hvilket indikerer, at det er en ideel erstatning for den traditionelle SGE-metode.
Introduction
Slabelelektroforese (SGE) er den mest effektive metode til separation af DNA fra 1 , 2 , 3 , 4 , 5 og anses således for et alsidigt redskab i biokemiske og biologiske analyser 6 , 7 , 8 . Mange eksperimenter indikerer imidlertid, at SGE er begrænset af følgende fire problemer: (1) separationerne tager mange timer og lige dage; (2) det kemiske forbrug er meget højt; (3) det kræver et kompliceret apparat ( f.eks. 2D elektroforese celle, elektroforese strømforsyning og gel billeddannelse system); (4) gel-billeddannelsessystemet kan kun observere de adskilte DNA-fragmenter, når eksperimentet er afsluttet. Desuden er ethidiumbromid (EtBr), som almindeligvis anvendes i SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, er mutagent og cancerogen 11 , 12 . Handsker bør således altid bæres, når der afsættes geler, der indeholder EtBr.
Kapillærelektroforese (CE) har mange fordele 13 , 14 , 15 , 16 , 17 i forhold til SGE, såsom automatisk drift, kort adskillelsestid og lavere forbrug. CE-instrumentet er dog ret dyrt. For at overvinde disse begrænsninger er der derfor udviklet et system ( figur 1 ) til separation af DNA. Et sådant system kan ikke kun kraftigt reducere det kemiske forbrug og spare på SGE-eksperimentet (<8 min), men det kan også udføre realtidssporing af DNA-separationsprocessen i agarosegelen ved hjælp af smartphone. Ved at følge de procedurer, der er beskrevet i denne protokol, skal eleverne shouJeg kan designe og fremstille SGE-chip, forberede agarosegelen i chippen, oprette et simpelt SGE-system med en smartphone og registrere DNA-migrationsprocessen i agarosegelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Agarosegelelektroforese anvendes i vid udstrækning til separationen af DNA, RNA og protein. Dette arbejde foreslår en ny metode til at erstatte den traditionelle gelelektroforese protokol. Resultater viser, at 50, 100 og 1000 bp DNA stiger kan adskilles godt i en sådan lille samlet enhed. Den store fordel ved denne metode er, at den ikke alene kan adskille nucleinsyrerne med lidt kemisk forbrug, men det kan også registrere separationsprocessen. Selvom DNA-fragmenterne ser bredt ud i figur …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender taknemmeligt støtte fra National Natural Science Foundation of China (nr. 21205078) og forskningsfonden for Ph.d.-uddannelsen i Kina (No.20123120110002). Dette arbejde blev delvist støttet af Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2016YFB1102303), Kinas nationale grundforskningsprogram (973Program; 2015CB352001) og National Natural Science Foundation of China (61378060).
Materials
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 |
| 50bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A |
| 100bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A |
| 1kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
Referencias
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
