Preparazione su media scala di<em> Drosophila</em> Estratti di embrioni per esperimenti proteomici
Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio semplice e poco costoso per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g) e la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati nelle applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa di purificazione-affinità (AP-MS ).
Abstract
L'analisi delle interazioni proteine-proteine (PPI) è diventata un approccio indispensabile per studiare processi e meccanismi biologici, come la segnalazione cellulare, lo sviluppo dell'organismo e la malattia. Spesso è auspicabile ottenere informazioni PPI utilizzando materiale in vivo , per ottenere la visione più naturale e imparziale delle reti di interazione. La mosca di frutta Drosophila melanogaster è un'ottima piattaforma per studiare i PPI in vivo e si presta ad approcci semplici per isolare il materiale per esperimenti biochimici. In particolare, gli embrioni a base di frutta rappresentano un tipo di tessuto conveniente per studiare PPI, a causa della facilità di raccolta degli animali in questa fase di sviluppo e del fatto che la maggior parte delle proteine sono espresse in embriogenesi, fornendo così un ambiente rilevante per rivelare la maggior parte dei PPI. Qui presentiamo un protocollo per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g), che è una quantità ideale per una vasta gamma diApplicazioni proteomiche, compresa l'analisi di PPI per purificazione di affinità-spettrometria di massa (AP-MS). Descriviamo i nostri disegni per le gabbie da 1 L e 5 L per le collezioni di embrioni che possono essere facilmente e poco costose in qualsiasi laboratorio. Inoltre forniamo un protocollo generale per la raccolta di embrioni e per l'estrazione di proteine per generare lisati che possono essere utilizzati direttamente nelle applicazioni a valle, ad esempio AP-MS. Il nostro obiettivo è quello di fornire un mezzo accessibile a tutti i ricercatori per effettuare le analisi di PPI in vivo .
Introduction
Gli schermi genetici e, più di recente, gli approcci genomici hanno rivoluzionato lo studio delle funzioni biologiche. Tuttavia, importanti informazioni cellulari sono codificate in proteine e nel loro insieme di partner interagenti. Mentre le schermate di modifica genetica tradizionali possono identificare componenti di percorso che limitano il tasso e recuperare interazioni indirette, la forza degli approcci proteomici è nella loro capacità di identificare reti complete di interazione immediata di proteine di interesse. La proteomica è quindi un prezioso metodo ortogonale per studiare sistemi biologici e completa la genomica, le trascrizioni e gli schermi genetici tradizionali. La spettrometria di massa di purificazione di affinità (AP-MS) ha dimostrato di essere un approccio potente per studiare le interazioni proteine-proteine (PPI) nel loro ambiente nativo nelle cellule e nei tessuti 1 , 2 . Questo metodo consente di identificare interazioni dirette o indirette in uno sviluppo specificoStadi o contesti tissutali ed è stato utilizzato con successo per identificare più PPI nuovi in una varietà di percorsi di sviluppo (riveduti nel riferimento 1 ). Nonostante il successo indiscusso degli studi PPI, la maggior parte di essi è stata effettuata in cellule colte, in cui le proteine "esche" di interesse sono state sovraespresse. Ci sono due problemi con lo studio di PPI nella cultura cellulare: in primo luogo, una linea cellulare specifica non può fornire un completo complemento di interazioni a causa della mancanza di espressione di determinate proteine. In secondo luogo, un'alta sovraespressione di solito impiegata in tali analisi potrebbe portare a manufatti come la misfolding della proteina o l'identificazione di interazioni false positive.
Entrambe queste limitazioni possono essere superate analizzando i PPI in vivo . Una fase di limitazione in tali esperimenti è la disponibilità del materiale di partenza per la purificazione di complessi proteici. Drosophila melanogaster è da tempo utilizzato come modello per l'analisi funzionaleSis, e recentemente è anche stato dimostrato di essere un eccellente sistema per lo studio di PPI in vivo . L'embriogenesi di Drosophila rappresenta un tipo di tessuto particolarmente attraente per studiare i PPI, perché gli embrioni possono essere facilmente raccolti in grandi quantità e anche perché la maggior parte dei geni (> 88%) sono espressi nel corso dell'embrenogenesi, fornendo così un ambiente ricco in vivo per rilevare le PPIs 3 .
Tradizionalmente, studi biochimici sulle mosche usavano raccolte di embrioni su larga scala (100-150 g), come quelle necessarie per la purificazione di lisati transcrizionali funzionali 4 , 5 . Precedenti studi AP-MS in Drosophila necessitano anche di grandi quantità di embrioni (5-10 g), poiché si sono basati su un approccio di purificazione a due fasi, come la tatim di affinità tandem (TAP), con la conseguente perdita di materiale in ogni fase 6 . Grande amounTs di materiale di partenza ha richiesto la creazione di collezioni di embrioni in grandi gabbie di popolazione, che possono essere costose (quando acquistate in commercio) e richiedono molto tempo per mantenere e pulire 7 , 8 , 9 .
I progressi recenti nello sviluppo di approcci di purificazione di affinità a singola fase, nonché la crescente sensibilità degli spettrometri di massa, hanno ridotto la quantità necessaria di materiale di partenza per un ordine di grandezza. Utilizzando tag come il peptide legante streptavidina (SBP) o la proteina fluorescente verde (GFP) e partendo da meno di 1 g di embrioni, è possibile isolare le quantità della proteina dell'esca e dei componenti interagenti che sarebbero sufficienti per l'identificazione Spettrometria di massa 10 , 11 .
L'obiettivo del protocollo qui presentato è quello di aiutare i ricercatori a superareUna barriera percepita all'analisi biochimica dei PPI in vivo . A tal fine, forniamo una procedura semplice e poco costosa per raccogliere embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g), seguita da una fase di preparazione di estratti proteici interi di cellule che sono idonei per l'analisi successiva da AP-MS o da altri approcci . Il nostro metodo si basa sull'utilizzo di gabbie di popolazione personalizzate da 1 o 5 L che possono essere facilmente prodotte da qualsiasi laboratorio. Inoltre, le condizioni di estrazione qui presentate sono state convalidate in diversi studi, sia in cellule colte che in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato è una procedura semplice e generale per la creazione di gabbie di popolazione Drosophila a media scala e la realizzazione di proteine intere di cellule da embrioni. Gli estratti risultanti possono essere utilizzati in una varietà di applicazioni a valle, come la purificazione di complessi proteici sulle resine di affinità. È fondamentale eseguire le fasi di estrazione sul ghiaccio e utilizzare una forte inibizione della proteasi, per minimizzare il degrado delle proteine. …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i membri del laboratorio di Veraksa per avere commenti utili sul manoscritto e sui suggerimenti per migliorare i protocolli. AV è stato sostenuto dal NIH concede GM105813 e NS096402. LY è stato sostenuto dall'Università del Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
Referencias
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