Summary

Préparation à moyen terme de<em> Drosophila</em> Extraits d'embryons pour les expériences protéomiques

Published: May 30, 2017
doi:

Summary

Le but de ce protocole est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5-1 g) et préparer des extraits de protéines qui peuvent être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la purification par affinité, la spectrométrie de masse (AP-MS ).

Abstract

L'analyse des interactions protéines-protéines (IPP) est devenue une approche indispensable pour étudier les processus et mécanismes biologiques, tels que la signalisation cellulaire, le développement de l'organisme et la maladie. Il est souvent souhaitable d'obtenir des informations PPI en utilisant du matériel in vivo , afin d'obtenir la vision la plus naturelle et la plus imparfaite des réseaux d'interaction. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est une excellente plate-forme pour étudier les IPP in vivo et se prête à des approches directes pour isoler le matériel pour les expériences biochimiques. En particulier, les embryons de mouche des fruits représentent un type de tissu approprié pour étudier les PPI, en raison de la facilité de collecte des animaux à cette étape de développement et du fait que la majorité des protéines sont exprimées dans l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement pertinent pour révéler la plupart des IPP. Nous présentons ici un protocole pour la collecte d'embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), ce qui constitue un montant idéal pour une large gamme deApplications protéomiques, y compris l'analyse des IPP par spectrométrie de masse par purification par affinité (AP-MS). Nous décrivons nos modèles pour les cages 1 L et 5 L pour les collections d'embryons qui peuvent être facilement et peu coûteuses dans n'importe quel laboratoire. Nous proposons également un protocole général pour la collecte des embryons et l'extraction des protéines pour générer des lysats qui peuvent être utilisés directement dans les applications en aval telles que l'AP-MS. Notre objectif est de fournir un moyen accessible à tous les chercheurs d'effectuer les analyses des IPP in vivo .

Introduction

Les écrans génétiques et, plus récemment, les approches génomiques ont révolutionné l'étude des fonctions biologiques. Cependant, des informations cellulaires importantes sont codées dans les protéines et leur ensemble de partenaires en interaction. Alors que les écrans modificateurs génétiques traditionnels peuvent identifier les composants de la voie limitant le taux et récupérer les interactions indirectes, la force des approches protéomiques réside dans leur capacité à identifier des réseaux complets d'interactions immédiates de protéines d'intérêt. La protéomique est donc une méthode orthogonale précieuse pour étudier les systèmes biologiques et complète la génomique, la transcriptomie et les écrans génétiques traditionnels. La purification par affinité – la spectrométrie de masse (AP-MS) s'est révélée être une approche puissante pour étudier les interactions protéines-protéines (IPP) dans leur milieu naturel dans les cellules et les tissus 1 , 2 . Cette méthode permet d'identifier des interactions directes ou indirectes à un développement spécifiqueDes étapes ou des contextes tissulaires, et a été utilisée avec succès pour identifier de multiples IPP nouveaux dans une variété de voies de développement (examinées dans la référence 1 ). Malgré le succès incontesté des études PPI, la plupart d'entre elles ont été réalisées dans des cellules cultivées, dans lesquelles les protéines d'intérêt "appât" ont été surexprimées. Il existe deux problèmes avec l'étude des PPI dans la culture cellulaire: premièrement, une lignée cellulaire spécifique peut ne pas fournir un complément complet d'interactions en raison du manque d'expression de certaines protéines. Deuxièmement, une forte surexpression habituellement utilisée dans de telles analyses pourrait conduire à des artefacts tels que le repli des protéines ou l'identification d'interactions faussement positives.

Ces deux limites peuvent être surmontées en analysant les IPP in vivo . Une étape limitante dans de telles expériences est la disponibilité du matériau de départ pour la purification des complexes de protéines. Drosophila melanogaster a longtemps été utilisé comme modèle d'analyse fonctionnelleSis, et récemment, il a également été démontré qu'il s'agissait d'un excellent système d'étude des IPP in vivo . L'embryogenèse de Drosophila représente un type de tissu particulièrement attrayant pour étudier les IPP, car les embryons peuvent être facilement collectés en grandes quantités, et aussi parce que la plupart des gènes (> 88%) sont exprimés au cours de l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement riche in vivo pour détecter des facteurs pertinents PPI 3 .

Traditionnellement, les études biochimiques dans les mouches utilisaient des collections embryonnaires à très grande échelle (100-150 g), telles que celles nécessaires à la purification des lysats fonctionnels transcriptionnels 4 , 5 . Les études AP-MS antérieures chez Drosophila nécessitaient également de grandes quantités d'embryons (5-10 g), car elles reposaient sur une approche de purification en deux étapes telle que la purification par affinité en tandem (TAP), avec la perte de matériau associée à chaque étape 6 . Grand amounLe matériel de départ nécessitait la mise en place de collections d'embryons dans de grandes cages de population, ce qui peut coûter cher (lorsqu'ils sont achetés sur le marché) et long-temps pour maintenir et nettoyer 7 , 8 , 9 .

Les progrès récents dans le développement des approches de purification d'affinité à une étape, ainsi que la sensibilité croissante des spectromètres de masse, ont réduit la quantité nécessaire de matériau de départ d'un ordre de grandeur. En utilisant des marqueurs tels que le peptide de liaison à la streptavidine (SBP) ou la protéine fluorescente verte (GFP) et à partir de moins de 1 g d'embryons, il est possible d'isoler les quantités de protéines d'appât et les composants interactifs qui seraient suffisants pour l'identification par Spectrométrie de masse 10 , 11 .

L'objectif du protocole présenté ici est d'aider les chercheurs à surchargerMoi, une barrière perçue à l'analyse biochimique des IPP in vivo . À cette fin, nous proposons une procédure simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), suivie d'une préparation en une étape d'extraits de protéines de cellules entières qui conviennent pour une analyse ultérieure par AP-MS ou d'autres approches . Notre méthode repose sur l'utilisation de cages de population sur mesure de 1-L ou 5-L qui peuvent être facilement produites par n'importe quel laboratoire. En outre, les conditions d'extraction présentées ici ont été validées dans plusieurs études, à la fois dans des cellules cultivées et in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Protocol

1. Préparation des cages à vapeur de 5 L (pour ajuster les plaques de 15 cm) Obtenir les matériaux nécessaires: récipient de 5-quart (4.7-L) avec couvercle ( Figure 1A ), maille en nylon et une lame de rasoir. Marquez un cercle de 12 cm de diamètre et coupez un trou dans le fond du récipient à l'aide de la lame de rasoir ( Figure 1B ). Couper un trou de 15 cm de diamètre dans le couvercle ( Figure 1C</stron…

Representative Results

Pour illustrer l'utilisation de ce protocole dans une expérience de purification de complexe de protéines, nous avons généré une ligne de mouche viable homozygote, bras-EGFP-ERK , exprimant la kinase extracellulaire régulée par Drosophila marquée par EGFP (ERK, codée par le gène roulé ) sous le contrôle D'un promoteur omniprésent d' armadillo ( bras ) 18 , 19 . Le p…

Discussion

Le protocole présenté ici est une procédure simple et générale pour la mise en place des cages de population de Drosophila à l'échelle moyenne et la production d' extraits de protéines à cellules entières à partir d'embryons. Les extraits résultants peuvent être utilisés dans une variété d'applications en aval, telles que la purification de complexes de protéines sur des résines d'affinité. Il est essentiel d'effectuer les étapes d'extraction sur la glace…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient les membres du laboratoire de Veraksa pour des commentaires utiles sur le manuscrit et des suggestions pour l'amélioration des protocoles. AV a été soutenu par les subventions NIH GM105813 et NS096402. LY a été soutenu par la bourse de doctorat de Boston Sanofi Genzyme de l'Université du Massachusetts.

Materials

Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

Referencias

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Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

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