Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler
Summary
Biz burada mikroenjeksiyon kuvars iğneleri kullanan kemirgen beyin için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu iğneler değil algılanabilir doku hasarı üretmek ve derin bölgelerde bile güvenilir teslim edilmesini sağlamak. Ayrıca, araştırma ihtiyaçlarına tarafından kişiselleştirilmiş tasarımlar adapte edilebilir ve yeniden kullanılabilir.
Abstract
Microinjections uyuşturucu ya da toksinlerin belirli beyin bölgeleri içinde teslim etmek için uzun süre kullanılmıştır ve daha yakın zamanlarda, bunlar gen veya hücre terapi ürünleri teslim etmek için kullanılmıştır. Ne yazık ki, şu anki mikroenjeksiyon teknikleri için birden çok nedeni suboptimal çelik veya cam iğne kullanın: özellikle, çelik iğneler doku hasarına neden olabilir ve cam iğne eğmek derinden hedef bölge eksik beyin düşürdü. Bu makalede, biz hazırlamak ve yararlı özellikleri birleştirmek kuvars iğne kullanmak için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu iğneler tespit doku hasarı üretmek değildir ve çok sert olmak, güvenilir teslim istenen beyin bölgesinde derin koordinatları kullanırken bile olun. Ayrıca, birden fazla delik istenilen çap yaparak iğne tasarımını kişiselleştirmek mümkündür. Enjeksiyon hücrelerinin büyük delikler kolaylaştırmak, ancak birden fazla delik çözüm daha büyük bir alan içinde büyük miktarda enjeksiyon kolaylaştırmak. Buna ek olarak, bu kuvars iğneler temizlenmesi ve kullanılan, yeniden öyle ki yordamı maliyet-etkin hale gelir.
Introduction
Microinjections farmakolojik aktif bileşikler teslim etmek için uzun bir süre için belirli beyin alanlarda nöronal aktivite modüle için kullanılmıştır. Buna ek olarak, toksinler nörodejeneratif olaylar karakteristik bazı hastalıkların, örneğin 6-hidroksi-Parkinson hastalığı taklit etmek için nigrostriatal dopamin sisteminde dopamin taklit etmek için belirli nöron popülasyonları yakınındaki enjekte kullanılmıştır 1 , 2 veya anma 192 IgG saporin lezyon kolinerjik sistemi3için. Daha yakın zamanlarda, mikroenjeksiyon işlemleri viral vektörler veya hücreleri Greftler deneysel beyin bozuklukları4,5gen veya hücre tedavisi için teslim etmek için kullanılmaktadır.
Bu çalışmalarda kullanılan iğneler klasik tip paslanmaz çelikten imal edilmiştir. Ne kadar kolay ve pratik kullanmak, bir dizi sorunları6çelik iğneler var: onlar nispeten büyük ve doku hasarı, kan – beyin bariyerini kaçağı ve astrocytes; aktivasyonu ile neden Ayrıca, onlar bir engel oluşturmak veya hatta tamamen kaçınmak istediğiniz çözüm akışının iğne alır beyin dokusunun Asitleme üretebilir. Daha yakın zamanlarda, hazırlanan özel kılcal damarlar üzerinden tanıtıldı içinde cam iğne7,8kullanın. Bunlar önemli doku hasarı ne de astrocyte harekete geçirmek, neden olmaz ama nispeten esnek ve yerelleştirme (kişisel gözlemler) doğruluğunu azaltarak derin yapılarını tanıttığında viraj.
Bu nedenle olası hasar olduğu kadar hassasiyet ve tekrarlanabilirlik artırırken (özellikle hasar iyileşir deneyler yaparken) azaltmak için bir ihtiyaç olduğunu (Yani, tüm çözüm iletilmesini sağlamak ve doğru yerelleştirme emin olun). Ayrıca, en iyi beyin alanlarda değişen geometrileri ile enjekte çözüm dağıtımını sağlamak için farklı iğne tasarımları kullanmak arzu olacaktır. Bu makalede, biz hazırlamak ve kuvars iğneler microinjections kemirgen beyin için kullanmak için bir iletişim kuralı tanımlamak. Yüksek erime noktası nedeniyle kuvars kılcal bir geleneksel çektirmenin çekti ve bu nedenle, geçmişte iğneler oluşturmak için kullanılmamış. Kuvars, ancak, cam, özellikle yüksek sertlik ve ara direnç9bazı önemli avantaj sunar. Onların sertlik nedeniyle kuvars iğneler ideal enjeksiyonları ventral beyin bölgeleri için uygundur. Onların kırılma direnci nedeniyle onlar bile karmaşık geometriler10ile beyin bölgeleri hedefleme en etkili kanıtlayabilir tasarımlar elde birden fazla delik eklemek modellenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan tekniği için çeşitli amaçlar12gerçekleştirilen microinjections optimize etmek için giriş bölümünde özetlenen ihtiyaçlarını yerine getirir. Burada açıklanan iğneler zarar en az, aslında algılanabilir seviyeye azaltmak; varyans (viraj eğilimli olduğunu) cam iğneler ile kuvars iğneler sert ve derin koordinatlarındaki bile istenen beyin bölgesi güvenilir bir doz emin olun. Ayrıca, ucu delik beyin dokusu içinde ekleme sırasında t?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Avrupa Topluluğu [FP7-insanlar-2011-IAPP proje 285827 (EPIXCHANGE)] bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
Referencias
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
